胃癌中Runx3基因甲基化表达及临床研究

何小兵，张海元 王卫政

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023) (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院消化内科，湖北 荆州 434000)

胃癌中Runx3基因甲基化表达及临床研究

何小兵，张海元 王卫政

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023) (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院消化内科，湖北 荆州 434000)

目的：通过检测胃癌中Runx3基因启动子区域甲基化状态及Runx3基因表达情况，探讨Runx3基因启动子区域甲基化及表达在胃癌发生和发展过程中的意义。方法：采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对9种胃癌细胞系和35例胃癌患者手术切除肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测，同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runx3 mRNA的表达情况。结果：在7种胃癌细胞系中Runx3基因启动子区域过度甲基化；Runx3基因在35例胃癌及其癌旁组织中甲基化率分别为40.0 %(14/35) 和8.6 %(3/35)；胃癌组织标本中Runx3基因表达(0.5938±0.1007) 较癌旁正常组织表达(0.8311±0.2872)明显下调，差异有统计学意义(Plt;0.05)。Runx3 mRNA在胃癌标本的表达与其病理临床特征密切相关，在伴有淋巴结转移和低分化的胃癌组织标本中Runx3 mRNA的表达显著下调(Plt;0.01)。结论：Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一，与胃癌的发生发展密切相关，可作为胃癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。

胃癌；Runx3基因；甲基化；细胞系；甲基化特异性PCR；逆转录-聚合酶链反应

胃癌是世界范围内发病率仅次于肺癌的恶性肿瘤，在我国胃癌是发病率和死亡率很高的恶性肿瘤之一[1]。通过研究表明，胃癌是一类多基因疾病，其发病分子机制是由于端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等[2-5]引发的多因素、多阶段及多基因变异综合病变过程。尽管癌基因的活化是促使肿瘤发生的关键因素之一，但抑癌基因的失活在胃癌的发生、发展过程中可能起到更加常见、更加重要的作用[6]。Runx基因(runt-related transcription factor gene)是近年来发现的一种新型抑癌基因，与人类多种肿瘤的发生、发展有着极其密切的关系，受到国内外学者的广泛关注。Runx家族基因的产物分别具有不同的生物学功能，其中Runx3对脊神经节的神经发育及胃粘膜上皮细胞的增生有调节作用，在胃癌中Runx3基因对癌细胞的生长有明显的抑制作用。Runx3基因在胃癌中主要以基因纯合或杂合缺失以及启动子区域过度甲基化方式失活，其中基因甲基化是表达下调的重要机制。本文主要采用MSP方法[7]检测了9种胃癌细胞系和35例胃癌肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因甲基化状态[8]，同时利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测胃癌细胞系和胃癌肿瘤组织及其癌旁组织中Runx3 mRNA的表达情况，阐明Runx3基因启动子甲基化与胃癌发生、发展过程的关系，从而探讨Runx3基因成为胃癌早期诊断的分子标记物的可能性。

1 对象与方法

1.1对象 35例胃癌组织及相对应的癌旁正常组织取自湖北省肿瘤医院和鄂州市中心医院肿瘤科2007年6月至2008年9月手术切除标本，所选取的胃癌患者术前均未实施放疗或化疗，患者年龄38～76岁，平均年龄59岁，其中男32例，女5例。

1.2方法

1.2.1标本处理 取胃癌及相关癌旁组织各一份，组织离体后立即一分为二，一份先置于液氮中速冻10min，然后置于-80℃冰箱中保存。另一份以40g/L甲醛溶液固定，制作常规病理切片，通过HE染色，确定病理诊断。

1.2.2基因组DNA提取及甲基化PCR 利用常规酚/氯仿抽提法提取DNA,并置于-20℃冰箱中暂存。取4μg DNA用去离子水稀释至90μl，参照MSP方法[7]对稀释的DNA进行预处理，按照Wizard DNA Clean-up Systerm说明书进行纯化DNA，用50ml TE溶解DNA,储存于-20℃冰箱中备用。设计两对Runx3基因的甲基化引物和非甲基化引物。见表1。

PCR反应体系总体积为30μl: DNA 5μl, 10×缓冲液3μl， 氯化镁 2.5mmol/L, 引物0.5mmol/L,dNTP(各2.5mmol/L)4.8μl, Hotstar Taq 0.5μl。MSP反应条件：95℃ 15min,95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s,35个循环，72℃ 10min。

1.2.3总RNA抽提及RT-PCR 按照QIAamp RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA；将组织标本研磨后，采用Trizol试剂按照说明书提取组织样本总RNA.通过紫外分光光度计定量总RNA,调整浓度为1μg/μl, 通过反转录酶(SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase)进行逆转录cDNA。设计引物PsCA、PsCB: PsCA:5’GAGTTTCACCCTGACCATCACTGTG 3’; PsCB: 5’GCCCATCACTGGTCTTGAAGGTTGT 3’。用β-actin作为内参照，进行RT-PCR，反应条件为：95℃ 15min, 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 45s,30个循环，72℃ 10min；PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，电压60V,60min。

1.3统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理，进行t检验、χ2检验和Fisher确切概率法，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同胃癌细胞系MSP结果 细胞系AZ521中Runx3基因启动子区域部分甲基化，细胞系SNU5中Runx3基因启动子区域未甲基化，其余7种胃癌细胞系中Runx3基因启动子区域高度甲基化。见图1。

图1 不同胃癌细胞系MSP结果

2.2Runx3基因在胃癌和癌旁正常组织的甲基化率 在胃癌组织中，Runx3基因启动子区域甲基化率占40.0 %(14/35)，而在相对应的癌旁正常组织中，Runx3基因启动子区域甲基化率占8.5%(3/35)，两者差异有统计学意义(χ2=9.04，Plt;0.01)。

2.3不同胃癌细胞系RT-PCR结果 Runx3 mRNA在胃癌细胞系SNU5和AZ521中有表达，在其余7种细胞系中未见表达，见图2。其结果与本文中9种胃癌细胞系MSP结果相符，可以说明在胃癌细胞系中，Runx3基因启动子区域甲基化是Runx3基因失活的主要机制之一。

图2 胃癌细胞系中RT-PCR结果

2.4Runx3 mRNA在胃癌和癌旁正常组织中的表达 胃癌组织标本中Runx3基因表达(0.5971±0.1013)较癌旁正常组织表达(0.8297±0.2912)明显下调，差异有统计学意义(t=4.46，Plt;0.05)。

2.5胃癌组织Runx3基因mRNA表达与临床病理特征的关系 采用Fisher确切概率法计算P值，结果显示，Runx3的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移有关(Plt;0.01)，而与年龄、性别及肿瘤大小无关(Pgt;0.05)。见表2。

表2 胃癌组织Runx3基因mRNA表达与临床病理特征的关系 例

3 讨 论

DNA甲基化是表观遗传修饰的一个重要方式，DNA的甲基化状态受到DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的调节，该酶能使CpG岛的胞嘧啶环5’位的氢被s-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，变成5’-甲基胞嘧啶[9]。DNA甲基化主要发生在富含CpG岛的启动子区域，通过该区域的甲基化将直接阻碍转录因子如AP-2、c-Myc/Myn、CREB、E2F等与启动子结合，从而使基因不能转录或转录水平降低[10]，这在正常细胞是调节基因表达的手段，但在肿瘤中，肿瘤抑制基因的异常甲基化能促进肿瘤的发生，导致恶性表型[11]。目前发现，在几乎所有的人类肿瘤中都存在CpG岛的过甲基化现象，但各种不同类型的肿瘤中，检测到发生甲基化的基因及甲基化的状态并不一致。实际上，到目前为止，大多数学者都认为甲基化的异常是导致某些重要基因，如MGMT、BRCA1等失活的最常见的原因，而这些基因与肿瘤的直接相关性提示我们甲基化的异常在肿瘤的形成和发展中起着重要的推动作用。Runx3基因是一种新型的抑癌基因，目前已经在肝癌、胆道肿瘤、肺癌、婴儿睾丸内胚窦瘤中发现Runx3基因过度甲基化现象。Waki等研究10个胃癌细胞系，有70.0%(7/10)细胞系被检测Runx3基因甲基化，而通过胃癌患者手术标本研究显示，45%肿瘤组织(42/93)和8%(7 /93)癌旁正常组织发生了Runx3基因甲基化。本文采用MSP方法检测了9个胃癌细胞系，发现有77.8%(7/9)细胞系被检测到Runx3基因过度甲基化；在35例胃癌患者手术切除标本胃癌组织及其癌旁组织Runx3基因甲基化与报道的研究结果相似。本文利用RT-PCR方法显示在9个胃癌细胞系中，2个Runx3基因启动子区域未过度甲基化的细胞系存在Runx3基因表达，其结果与MSP结果相符。在胃癌组织中Runx3基因的表达量明显低于癌旁正常组织，Runx3基因在伴有淋巴结转移组及低分化组中的表达明显低于未转移组和高分化组。本研究通过对胃癌细胞系及癌组织中Runx3基因甲基化与表达情况研究，推断Runx3基因启动子区域的过度甲基化可能是导致该基因转录失活及其表达下调的主要原因，从而与胃癌的发生发展密切相关。因DNA甲基化在肿瘤的形成中普遍存在， DNA甲基化改变是一种可逆的表观遗传修饰，因此，DNA甲基化转移酶(DNMT)成为目前DNA去甲基化恢复抑癌基因功能的热点靶分子，通过DNMT抑制剂，可以使肿瘤中许多过甲基化的基因被重新激活。这提示我们在胃癌中可以Runx3基因为治疗靶点，用DNMT抑制剂，如5-aza-2’-deoxycytidine(decitabine)、Fazarabine、zebularine等诱导沉默的Runx3基因重新表达的方法对胃癌进行基因治疗。

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[编辑] 一 凡

R730.231

A

1673-1409(2009)02-R016-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.005

2009-03-02

湖北省教育厅中青年项目(Q20091207)

何小兵(1970-)，男，湖北京山人，讲师，从事生物化学与分子生物学教学与研究工作。