雄激素对去势大鼠弓状核AR蛋白表达的影响

田光明 范光丽

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434023) (西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨陵 712100)

雄激素对去势大鼠弓状核AR蛋白表达的影响

田光明 范光丽

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434023) (西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨陵 712100)

为了探讨雄激素(androgen)对去势大鼠弓状核(ARC)内雄激素受体(AR)表达的影响。将30只3月龄雄性健康SD大鼠随机分为GM组(睾丸摘除组)、IMC组(假手术组)、GM+T组(睾丸摘除并用睾酮替代组)，注射雄激素4周后灌注取材。结果表明，睾丸摘除组大鼠弓状核内AR蛋白的表达显著减少，睾丸摘除并用睾酮替代组大鼠弓状核内AR蛋白的表达接近正常水平。说明去睾丸大鼠由于缺乏内源性雄激素,引起弓状核内AR蛋白表达减少,而补充外源性雄激素可抑制这一变化。

去势；雄激素受体；雄激素；弓状核

雄激素是雄性体内的一种重要激素，在雄性个体发生、生长发育和生殖功能的各个方面都起着必不可缺的作用，如诱导性分化、第二性征的形成和维持、精子发生的起始与维持、垂体激素分泌的反馈调节等。雄激素主要是指睾丸Leydig细胞合成、分泌的睾酮(T)及其在靶细胞内的活性代谢产物—双氢睾酮(DHT)。雄激素(androgen)在调节下丘脑-垂体-性腺轴的神经内分泌活动以及影响其他脑区的神经结构与功能中均起着重要的调节作用[1]。雄激素作用的发挥是通过雄激素受体(Androgen receptors, AR)来实现的[2]。

弓状核(ARC)又称漏斗核，位于下丘脑内侧基底部第三脑室两侧与正中隆起背侧部，在冠状切面呈弓形[3]。弓状核为下丘脑神经内分泌的重要核团，和室旁核的小神经分泌细胞共同发出结节漏斗束，纤维终于垂体门脉系统的血窦，输送释放激素至垂体前叶，以调控前叶激素的合成与释放。在功能上，弓状核成为调节下丘脑激素分泌的闸门系统，它可把神经信息转换为内分泌信息作用于靶器官[4]。

本研究采用去势法建立阻断内源性雄激素大鼠模型，通过注射外源性睾酮，检测其对弓状核AR蛋白表达的影响，以期为阐明雄激素和雄激素受体在SD大鼠弓状核表达提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与动物模型的建立

3月龄雄性健康SD大鼠(购于第四军医大学实验动物中心)30只。随机分为睾丸摘除组(GM组)、假手术组(IMC组)和睾丸摘除并用睾酮替代组(GM+T组)。每组10只，大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，IMC组做假手术(只切开睾丸皮肤和纵隔,不切除睾丸)，GM组和GM+T组摘除双侧睾丸，GM+T组自手术1周后开始，隔天皮下注射300 μg/mL睾酮(Testosterone)，每只0.1 mL，连续注射4周。

1.2 标本采集及组织切片的制备

4周后，各组大鼠用水合氯醛腹腔麻醉、手术暴露胸腔、主动脉插管、100 mL生理盐水冲净血液后,用200 mL 4%多聚甲醛灌注固定。取下丘脑，于相同的固定液中固定12～36 h，浸入4 ℃ 200 g/L蔗糖PB液(pH7.4)中至组织沉底，将组织于开放式冰冻切片机上做连续冠状切片，切片厚30 μm。

1.3 大鼠弓状核中AR蛋白的检测

免疫组化染色程序按照试剂盒(福州迈新生物技术开发公司生产)说明进行，第一抗体AR多克隆抗体(武汉博士德公司生产)的工作浓度为1∶150 (体积比)，同时设阴性对照组，组织切片用硫酸镍铵增强的DAB(Sigma公司生产)呈色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察。表达AR蛋白的阳性细胞呈深蓝色或蓝色，阴性对照组细胞不表达AR蛋白,呈与背景色相似的淡蓝色。

1.4 统计学处理

2 结果与分析

表1 AR阳性细胞平均灰度值Table 1 Average gray scale of AR+ cell (±SD)

由图1和表1可知，GM+T组AR蛋白在弓状核中有表达。阳性产物灰度值均较GM组低(灰度值越低，着色越强)，AR阳性细胞数目比GM组显著增多，差异显著(Plt;0.05)，染色加深，接近正常水平；IMC组中AR蛋白主要分布于靶细胞胞质中，阳性细胞数目极显著增多，差异极显著(Plt;0.01)；GM组中AR蛋白的表达率则相对较低。

图1 弓状核中AR免疫阳性产物 (400×)Figure 1 The expression of AR in arcuate nucleus (400×)

3 讨论

下丘脑是中枢神经系统维持机体内环境稳定的最重要部位。刘晓柳等[1]首次分别从基因水平和细胞水平证实了AR在下丘脑的存在。而弓状核是下丘脑与垂体联系的核心部位，能够合成及分泌多种神经递质及肽类物质。损毁弓状核可导致睾酮分泌降低和睾丸萎缩[5]。Mong等[6]用丙酸睾酮处理阉割雄性大鼠后,弓状核的突起长度和分化频率以及神经元的分化均显著增加。Zwain等[7]证实雄激素和下丘脑神经元和星形胶质细胞结构和功能的调节相关。已有大量文献证明雄激素对机体生殖有调节作用。本研究发现雄激素受体表达于弓状核中，证实生殖系统和神经内分泌系统之间的密切联系。提示弓状核可能对生殖活动具有调节。

雄激素和下丘脑弓状核的相关文献已有较多报道[5,6]。但雄激素对弓状核中雄激素受体表达的调节研究尚处于起步阶段[1]，本研究证实了AR蛋白在弓状核的存在，且阻断内源性雄激素对弓状核中AR表达有明显影响，为研究雄激素对弓状核的调节作用提供了形态学依据。同时本实验采用30 μm冰冻切片，提高了免疫阳性产物的对比度。雄激素进行调节机体机能时，都依赖自身受体完成[2]。研究表明,雄激素可以通过雄激素受体介导的雄激素信号途径激活或抑制与细胞生存相关的基因,比如热休克蛋白家族[8]，使抗氧化蛋白表达增加[9]；通过AR依赖性的、快速的促分裂原活化蛋白激酶，细胞外信号调节激酶信号转导途径发挥神经元保护机制[10]。本研究中GM组雄激素受体表达明显低于IMC组和GM+T组，说明雄激素可能与弓状核行使的神经内分泌调节功能相关。

[1]刘晓柳，李光千，赵小明.雄性大鼠下丘脑雄激素受体蛋白及其mRNA表达的探讨[J].神经解剖学杂志,2003,19(4):423～426.

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[3]张殿明，徐隆绍.神经内分泌学[M].北京：中国医药科技出版社,1991.37～38.

[4]蒋文华.神经解剖学[M].上海：复旦大学出版社,2002.297～308.

[5]许 洁，秦 伟.壬基酚对雄性大鼠弓状核神经元单位放电的影响[J].现代医药卫生,2007,23(1):5～6.

[6]Mong J A, Glaser E, McCarthy M M,etal. Gonadal steroids promote glial differentiation and alter neuronal morphology in the developing hypothalamus in a regionally specific manner[J].Neuroscience,1999,19:1464～1472.

[7]Zwain I H, Yen S S. Dehydroepiandrosterone: biosynthesis and metabolism in the brain[J]. Endocrinology, 1999,140:880～887.

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[10]Nguyen T V, Yao M, Pike C J. Androgens activate mitogen-activated protein kinase signaling: Role in neuroprotection [J]. J Neurochem, 2005,94:1639～1651.

2009-07-08

田光明(1979-)，男，江苏盐城人，理学硕士，助教，研究方向为神经生物学.

范光丽，E-mail:guanglifan@yahoo.com.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.013

Q955

A

1673-1409(2009)04-S044-02