3个外种猪Nramp1基因多态性研究

杨 军 陈红颂，丁山河 王家圣 罗家琴，杨玉莹，彭本英 韩安勤

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010) (湖北省畜牧兽医局，湖北 武汉 430060) (湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010) (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025) (湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010)

3个外种猪Nramp1基因多态性研究

杨 军 陈红颂，丁山河 王家圣 罗家琴，杨玉莹，彭本英 韩安勤

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010) (湖北省畜牧兽医局，湖北 武汉 430060) (湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010) (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025) (湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场，湖北 荆州 434010)

采用PCR-RFLP方法，对3个外种猪群Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了检测。结果表明，在3个外种猪群中均仅检测到AB和BB 2种基因型，其中AB基因型为优势基因型，BB基因型为数极少，未检测到AA基因型。卡方检验结果表明，3个外种猪群该位点均处于遗传不平衡状态(Plt;0.01)。群体中该位点杂合度较高、纯合度较低，具有中度遗传多态性，可在后续的育种方案中实施分化选择和培育，为抗病育种提供遗传素材。

猪(Susscrofa)；Nramp1基因；PCR-RFLP；多态性

在动物育种中，人们一直追求主要经济性状生产能力的提高，往往忽略随之而来的拮抗效应——动物体质和抗病力的不断减弱，使得育种成效在实际生产中不能完全体现。畜禽疾病，尤其是传染性疾病已成为现代畜牧生产的大敌，而集约化程度的提高和饲养条件的改变，又引起许多新的传染病(尤其是病毒性疾病)的发生和流行。简单的预防接种和药物治疗不但不能完全有效地解决问题，还会引发食品安全担忧。因此，采用分子生物学手段，从遗传素质上提高动物的抗病力，实施抗病育种，是解决问题的有效途径之一。最初发现小鼠对细胞内病原微生物侵染所具有的抗性或敏感性是受1号染色体上显性基因控制，并将其该类基因命名为天然抗性相关巨噬蛋白(natural resistance associated macrophage protein，Nramp)基因家族[1]。该基因家族至少有2～3个成员，动物Nramp1基因主要在吞噬细胞如巨噬细胞和中性粒细胞中特异表达，通过消耗含有胞内病原微生物的吞噬体中二价金属离子，使病原微生物缺乏增殖所必需的离子而达到抵抗胞内微生物的作用[2～4]。猪Nramp1基因定位于第15号染色体q23-26，基因组序列15 kb左右，包括15个外显子和14个内含子，cDNA序列为1 617 bp，共编码539个氨基酸[5～7]。目前，国内外学者对Nramp1基因的抗病性研究作了大量工作。Hu[8]对鸡Nramp1基因与沙门氏伤寒菌感染的关系进行了研究，在一个易感系鸡Nramp1基因编码区发现特异的Arg223→Gln223突变。Liu等[9]研究发现，鸡Nramp1基因高度保守区的SNP多态性与青年鸡肠炎沙门氏菌疫苗接种及病原攻击后的免疫应答相关。罗文华[6]研究发现猪Nramp1基因的第6内含子存在多态性位点，吴宏梅等[10]在大白猪和松辽黑猪中证实了该多态位点，并发现该多态位点与猪中性粒细胞还原力和单核细胞的细胞毒作用百分率间存在显著相关，认为Nramp1基因可作为猪抗病力性状的一个主要候选基因。本研究以长白猪、大白猪和杜洛克猪3个外种猪为试验材料，检测Nramp1基因第6内含子PCR-RFLPs多态性，并进行群体遗传学分析，为标记辅助抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以湖北省畜牧兽医局桑梓湖种猪场核心群种猪共51头种猪为试验材料，其中杜洛克种猪10头(5公5母)，长白猪24头(7公17母)，大白猪17头(6公11母)。耳号钳采集猪只耳组织约200 g，放置于盛有70%乙醇的离心管中，-70 ℃保存待用。标记样品号和记录猪只耳号。

1.2 基因组DNA提取及引物设计

参照文献[11]提取耳组织基因组DNA，-20 ℃保存。采用吴宏梅等[10]的引物：上游引物，5’-GCC AGC TTC CAC AGT CTC CAG-3’；下游引物，5’-GGG GGT ACA AAG GGG AAG AAG-3’，扩增片段483 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 目的片段PCR扩增及酶切鉴定

PCR反应体系：模板DNA 100 ng，10×buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.25 μL，Taq DNA聚合酶1 U，加ddH2O至25 μL。

PCR反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

RFLP酶切分析：酶切体系中10×buffer(with BSA)1 μL，PCR产物2 μL，NdeⅠ1 μL，加ddH2O至10 μL，37 ℃恒温水浴孵育16 h。2%琼脂糖凝胶检测酶切产物，记录个体基因型。

1.4 群体遗传学分析

采用POPGEN32软件计算基因型频率、等位基因频率、基因位点杂合度(HE)和多态信息含量(PIC)，群体Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验(df=2)。

M为DL2000 DNA marker；1～9为483 bp特异性PCR产物图1 Nramp1基因第6内含子特异性PCR产物Figure 1 PCR products of intron 6 in Nramp1 gene

M为DL2000 DNA marker；27～35为AB基因型；36为BB基因型图2 Nramp1基因第6内含子NdeⅠ酶切结果Figure 2 NdeⅠ restriction results of intron 6 in Nramp1 gene

2 结果与分析

2.1 PCR产物扩增结果

对整个试验猪群的基因组进行扩增，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶进行检测，获得与目标片段大小一致的产物，且产物条带清晰无杂带、稳定性和特异性好，可直接用于酶切分析(图1)。

2.2 PCR产物酶切结果

利用限制性内切酶NdeⅠ对PCR产物进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测分型。当酶切位点存在时，NdeⅠ内切酶可特异性地将483 bp片段分成373 bp和110 bp 2个片段，从而产生AA基因型(483 bp)，BB基因型(373 bp、110 bp)和AB基因型(483 bp、373 bp、110 bp)。本研究中未检测到AA基因型(图2)。

2.3 3个外种猪群Nramp1基因群体遗传学分析结果

3个外种猪群Nramp1基因频率和等位基因频率结果以及Hardy-Weinberg遗传平衡检测结果见表1。从表1可以看出，3个猪群优势基因型均为AB基因型，其中杜洛克AB基因型频率为0.900 0，BB基因型频率为0.100 0；长白猪所有个体均为AB基因型，基因型频率为1；大白猪AB基因型频率为0.882 4，BB基因型频率为0.117 6。3个猪群A、B等位基因频率非常接近，呈均匀分布。Hardy-Weinberg遗传平衡检测结果表明，3个外种猪群Nramp1基因处于遗传不平衡状态(Plt;0.01)，说明对于3个外种猪群体而言，Nramp1基因可能控制的抗病性状已经被人为有意识和无意识地进行了选择，遗传平衡被打破。

表1 3个外种猪群Nramp1基因频率和基因型频率Table 1 Allelic and genotypic frequency of Nramp1 gene in three foreign pig herds

表2 3个外种猪群Nramp1基因多态性分析结果Table 2 Polymorphism of Nramp1 gene in three foreign pig herds

3个外种猪群Nramp1基因多态性分析结果见表2。除纯合度、杂合度能反映群体的遗传变异外，衡量群体一个位点的遗传变异指标还有多态信息含量(PIC)。对于一个群体而言，PIC值高、等位基因数目多、杂合度大，则该位点的遗传变异性就高，有较大的选择潜力；反之则说明该群体杂合度小、基因纯合度高，可以看作是纯系加以利用。从表中结果可以看出，就Nramp1基因位点而言，3个外种猪群杂合度高、纯合度低。因0.2lt;PIClt;0.5为中度多态，故可在后续选育方案中实施中等强度的选择，也可实施分化选育，即通过AB个体间交配，逐步选留纯合的AA和BB个体，为抗病育种培育更多的素材。

3 讨论

畜禽抗病性状是一个复杂的阈性状，受到遗传和环境因素的共同影响，常规的表型选择难以获得理想的改良效果。利用标记辅助育种(Marker-assistant Breeding，MAB)可以有效解决这个难题，前提是找到与抗病性状紧密连锁的遗传标记。Nramp1基因是天然抗性相关巨噬蛋白基因(Nramp)家族成员，被认为是控制动物抗病力性状的候选基因。本研究采用PCR-RFLP技术对杜洛克、长白猪和大白猪3个外种猪Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了检测分析，共检测到AB和BB两种基因型，其中AB基因型占绝对优势，BB基因型仅有3例，未检测到AA基因型，这与罗华文、吴宏梅等[6,10]的研究结果一致。3个群体Nramp1基因位点均处于遗传不平衡状态，可能与样本含量较小有关，也可能因为AA基因型为不利基因型，在长期的有意识和无意识的选择过程中，AA个体被逐渐淘汰，群体该位点的遗传平衡从而被打破。

多态性分析结果显示，3个外种猪群Nramp1基因位点杂合度都很高，其中杜洛克猪杂合度为0.900 0，大白猪杂合度为0.882 4，而长白猪杂合度为1。多态信息含量为中度多态，具有继续选择培育的潜力。特别是通过AB基因型个体间的交配，生产AA基因型和BB基因型纯合子，并培育成纯系，为抗病育种提供良好的遗传素材。

本研究的多态位点位于Nramp1基因的第6内含子内，若该位点的突变会对猪的抗病力产生任何影响，则更多的可能是，突变位点发挥了顺式作用，即通过突变改变核酸分子的高级构象，从而影响Nramp1基因的转录，或影响转录后的内含子剪接，进而影响蛋白质的合成和动物的疾病抵抗力。这需要后续更大群体的分子生物学检测以及基因多态下与抗病、免疫指标的关联分析。

[1]Belouchi A, Cellier M, Kwan T,etal. The macrophage specific membrane proteinNrampcontrolling natural to infections in mice has homologues expressed in the root system of plants[J]. Plant Molecular Biology, 1995, 29: 1181～1196.

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[11] 杨 军，唐登华，罗家琴. 一种快速提取鸭基因组DNA的方法[J]. 河南农业科学，2007，(10)：113～114.

2009-09-10

杨 军(1978-)，男，四川阆中人，农学博士，讲师，主要从事动物遗传育种与遗传资源保护.

王家圣，E-mail: hbszh1962@163.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.012

Q346+.5;S828

A

1673-1409(2009)04-S040-04