抵抗素在大鼠急性胰腺炎中的表达

徐克群 沈云志 龚燕芳 满晓华 吴洪玉 金晶

·论著·

抵抗素在大鼠急性胰腺炎中的表达

徐克群 沈云志 龚燕芳 满晓华 吴洪玉 金晶

目的检测抵抗素在大鼠急性胰腺炎(AP)中的表达，探讨其与胰腺病理改变的关系。方法40只SD大鼠按数字表法随机分为正常组、假手术组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组和急性坏死性胰腺炎(ANP)组。AEP组腹腔注射雨蛙素，ANP组腹腔注射精氨酸，正常组未做任何处理，假手术组腹腔注射等容量生理盐水。测定大鼠血清淀粉酶、抵抗素、TNF-α、IL-1β、C反应蛋白(CRP)水平，记录胰腺/体重比值，观察胰腺组织病理变化，免疫组化法检测胰腺组织抵抗素蛋白表达，实时定量PCR法检测胰腺组织抵抗素mRNA表达。结果抵抗素主要定位于胰腺腺泡细胞的胞质内。AEP组血清淀粉酶水平、胰腺/体重(g/kg)比值、胰腺组织病理评分、抵抗素mRNA表达量及血清抵抗素、IL-1β、TNF-α和CRP水平分别为(4377±343) U/L、(8.67±1.43)、(5.39±0.26)、(2.04±0.19)、(10.21±1.34) ng/ml、(184.18±45.24) pg/ml、(194.24± 44.81) pg/ml、(3586±63) ng/ml；ANP组分别为(6750±322) U/L、(9.33±1.76)、(7.81±0.28)、(3.29±0.30)、(15.14±0.84) ng/ml、(349.31±94.54) pg/ml、(315.59±37.04) pg/ml、(4345±244) ng/ml。两组均显著高于假手术组的(1442±183) U/L、(4.34±0.42)、(1.10±0.21)、(0.88±0.08)、(5.13±0.74) ng/ml、(108.74±31.03) pg/ml、(106.44± 21.31) pg/ml和(2895±165) ng/ml(Plt;0.01)，且该两组间差异也有统计学意义(Plt;0.01或Plt;0.05)。血清抵抗素水平与CRP、TNF-α、IL-1β水平及胰腺组织病理评分均呈正相关，相关系数r分别为0.711、0.871、0.794和0.812(Plt;0.01)。结论抵抗素与AP的发生、发展有关，其检测结果可能是评估AP严重程度的有价值的指标之一。

胰腺炎； 抵抗素； C反应蛋白； TNF-α； IL-1β

抵抗素(resistin)是新近发现的由脂肪细胞特异分泌的一种多肽类激素，与胰岛素抵抗有关，可引起肥胖和高三酰甘油血症[1]。现研究认为，抵抗素不仅仅与胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病有关，它还是一个重要的细胞因子，参与炎症、调控细胞因子的释放[2]。文献报道，急性胰腺炎(AP)时血抵抗素浓度升高,且与AP的严重程度相关[3-4]。为此，本文检测抵抗素在AP时的表达，分析其与AP病情的关系，为胰腺炎的治疗提供新的靶点。

材料与方法

一、动物分组及模型制备

40只健康雄性SD大鼠，购自第二军医大学实验动物中心，SFP级，在室温20～28℃、相对湿度40%～70%的动物房内饲养。采用随机数字表法分为正常组、假手术组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组和急性坏死性胰腺炎(ANP)组，每组10只。实验前12 h开始禁食，不禁水。AEP组腹腔注射雨蛙素(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司提供)40 μg/kg体重，间隔1 h再注射1次，第一次注射后12 h处死动物。ANP组腹腔注射精氨酸(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司提供)2 g/kg体重，间隔1 h再注射1次，第一次注射后24 h处死动物。正常组未做任何处理，假手术组给予同等容量的生理盐水腹腔注射，12 h后处死。

二、胰腺/体重比值及胰腺组织病理学检查

动物处死前称重，处死后分离整个胰腺称重，计算胰腺/体重(g/kg)比值。取胰头部及胰尾部组织，常规福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，应用Schmidt等[5]评分标准进行组织病理学评分。胰体部新鲜胰腺液氮保存。

三、血清淀粉酶、抵抗素、C反应蛋白(CRP)、TNF-α、IL-1β水平检测

动物处死后下腔静脉取血，分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶。采用ELISA试剂盒(均由美国Ramp;D公司提供)检测血抵抗素、CRP、TNF-α、IL-1β水平，严格按照试剂盒说明书操作。

四、胰腺组织抵抗素mRNA和蛋白表达检测

抵抗素蛋白表达采用常规免疫组化方法检测。兔抗鼠一抗由北京爱迪博生物科技有限公司提供。抵抗素mRNA表达采用实时定量PCR方法检测。应用Trizol试剂盒(美国invetrogen公司)提取胰腺组织总RNA，逆转录为cDNA。抵抗素引物序列：上游5′-TGCCAGTGCGGAAGCATAGA-3′ ，下游5-TCCAGACCCTACTCTCGTTT-3′，扩增产物196 bp；内参β-actin引物序列：上游5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′，下游5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，扩增产物201 bp。PCR反应条件：95℃ 1 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 45 s，40个循环，反应结束前95℃ 15 s、60℃ 60 s、99℃ 15 s。应用ABI7500 RealTime仪获得Ct值，通过公式换算相对表达量，△△Ct=△Ctt-△Cts-(CtT-CtTE)-(CtS-CtSE)，RQ=2-△△Ct，T为待测样本，S为正常胰腺组织，E为内参照。

五、统计学处理

结 果

一、胰腺/体重比值及胰腺病理改变

AEP组大鼠腹腔少量积液，胰腺明显水肿。ANP组大鼠腹腔内较多积液，胰腺明显水肿，散在出血斑，并可见局部皂化斑。正常组、假手术组、AEP组和ANP组大鼠的胰腺/体重比值分别为4.24±0.37、4.34±0.42、8.67±1.43和9.33±1.76，AEP组较正常组及假手术组显著升高(Plt;0.01)，ANP组又较AEP组显著升高(Plt;0.05)。

正常组、假手术组胰腺组织无明显变化(图1上A、B)；AEP组胰腺组织明显水肿, 胰腺叶间隔、小叶间隔间隙增大，炎性细胞浸润，腺泡水肿明显(图1上C)；ANP组胰腺叶间隔、小叶间隔间隙增大，炎性细胞浸润，腺泡水肿，部分坏死，小叶结构破坏，可见实质内出血(图1上D)。4组病理组织学评分分别为0.54±0.05、1.10±0.21、5.39±0.26和7.81±0.28，AEP组较正常组及假手术组显著升高(Plt;0.01)，ANP组又较AEP组显著升高(Plt;0.05)。

二、血清淀粉酶、抵抗素、CRP、TNF-α、IL-1β水平变化

正常组、假手术组、AEP组和ANP组大鼠血清淀粉酶水平分别为(1230±59)U/L、(1442±183)U/L、(4377±343)U/L和(6750±322)U/L；血抵抗素分别为(4.79±0.7)ng/ml、(5.13±0.74)ng/ml、(10.21±1.34)ng/ml、(15.14±0.84)ng/ml；IL-1β为(106.03±29.38)pg/ml、(108.74±31.03)pg/ml、(184.18±45.24)pg/ml和(349.31±94.54)pg/ml；TNF-α为(103.41±18.95)pg/ml、(106.44±21.31)pg/ml、(194.24±44.81)pg/ml和(315.59±37.04)pg/ml；CRP为(2664±150)ng/ml、(2895±165)ng/ml、(3586±63)ng/ml和(4345±244)ng/ml。AEP组较正常组及假手术组显著升高(Plt;0.01)，ANP组又较AEP组显著升高(Plt;0.05)。

三、血清抵抗素、CRP、TNF-α、IL-1β水平及胰腺病理评分之间的相关性

血清抵抗素水平与CRP、TNF-α、IL-1β水平均呈正相关(r=0.711，r=0.871，r=0.794，P值均lt;0.01)；血清抵抗素水平与胰腺组织病理评分也呈正相关(r=0.812，Plt;0.01)；血清CRP、TNF-α、IL-1β水平和胰腺组织病理评分也呈正相关(r=0.796，r=0.899，r=0.788，P值均lt;0.01)。

四、胰腺组织抵抗素mRNA和蛋白表达的变化

抵抗素主要定位于胰腺腺泡细胞胞质，胰岛细胞也强表达。在AEP、ANP时胰腺细胞胞质的表达增强(图1下C、D)。4组抵抗素mRNA相对表达量分别为0.83±0.05、0.88±0.08、2.04±0.19和3.29±0.30，AEP组较正常组及假手术组显著升高(Plt;0.01)，ANP组又较AEP组显著升高(Plt;0.05)。

图1正常组(A)、假手术组(B)、AEP组(C)和ANP组(D)胰腺的病理改变(上图，HE ×200)及抵抗素蛋白的表达(下图，免疫组化 ×200)

讨 论

2001年Steppan等[1]研究抗糖尿病的新药胰岛素增敏剂噻唑烷二酮作用机制时，在小鼠脂肪细胞中发现了一种由脂肪细胞特异分泌的蛋白质，为多肽类激素，它可引起胰岛素敏感性降低，故命名为抵抗素(resistin)。抵抗素与胰岛素抵抗有关[1]，并可抑制脂肪分化、参与炎症反应。最近一些研究表明，人外周血单核细胞抵抗素通过NF-κB信号转导上调IL-6和TNF-α的表达[6]；在大鼠和人的巨噬细胞，重组人抵抗素蛋白能通过NF-κB通路增加TNF-α、IL-12的合成和分泌[7]；在人巨噬细胞LPS通过“瀑布样级联反应”诱导抵抗素基因表达，参与炎症细胞因子的分泌[8]。因此，抵抗素参与胰岛素抵抗、高三酰甘油血症和炎症过程，也可能在急性胰腺炎(AP)的发病机制中发挥重要作用。本实验结果表明，AEP和ANP大鼠的血清抵抗素水平、胰腺组织中抵抗素的mRNA和蛋白表达均较正常大鼠明显升高(Plt;0.01)，而且ANP组升高较AEP组升高更明显(Plt;0.01)，胰腺组织抵抗素表达水平与胰腺病理损伤的严重程度呈正相关，说明抵抗素在AP的发病过程中被激活，并且参与了胰腺组织的损伤，在AP的发病机制中发挥了一定的作用。

在AP的发病过程中，尤其是ANP， TNF-α、IL-1β发挥了重要作用，TNF-α、IL-1β是AP最早增高的细胞因子，是多种细胞因子的始动因子之一，可以启动级联反应，促进胰腺组织的水肿、出血坏死和全身中毒血症的形成，并且可以作用于血管内皮细胞引起全身的症状如微循环休克等，加重胰腺的恶化[9]。 IL-1β是导致胰腺持续坏死和全身病情加重的重要因素,还可正反馈于TNF-α，增加其释放，形成恶性循环[10]。本实验结果也显示AEP和ANP时血清TNF-α和IL-1β水平都明显升高(Plt;0.01)，而且血清抵抗素水平与血清TNF-α和IL-1β水平呈正相关，提示抵抗素的激活可能通过激活NF-κB刺激了TNF-α和IL-1β的释放。

CRP是一种对急性炎症非常敏感的指标，是判断AP病情严重程度及预后的重要指标之一[11]。本结果显示，CRP与AP的病理评分呈正相关，而抵抗素与CRP及AP的病理评分也呈正相关(Plt;0.01),说明抵抗素也可以作为胰腺炎病情严重程度及预后判断的一个指标，以抵抗素为靶向的干预治疗有望成为一种新的治疗方法。

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2009-02-12)

(本文编辑：吕芳萍)

Expressionofresistininratsofacutepancreatitis

XUKe-qun,SHENYun-zhi,GONGYan-fan,MANXiao-hua,WUHong-yu,JINJin.

DepartmentofGastroenterology,ThirdAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Changzhou213003,China

SHENYun-zhi,Email:yunzhishen@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of resistin in rats of acute pancreatitis and the relationship between its expression and pancreatic pathologic changes.MethodsForty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, sham operation group, AEP group and ANP group. AEP model was induced by intraperitoneal injection of cerulein and ANP model was induced by intraperitoneal injection of L-arginine while the control group

no treatment, and the sham operation group received same volume injections of 0.9% saline solution. The serum amylase, C-reactive protein, TNF-alpha, IL-1 beta were determined by using ELISA, pancreas/body weight (g/kg) ratio was recorded, pancreatic pathology was examinated, the expression of resistin mRNA and protein in pancreas was detected by real-time PCR and immunohistochemistry.ResultsThe levels of amylase, pancreas/body weight ratio, pancreatic pathology score, expression of resistin mRNA, IL-1-beta, TNF-alpha and C-reactive protein in AEP group were (4377±343)U/L, 8.67±1.43, 5.39±0.26, 2.04±0.19, (10.21±1.34)ng/ml, (184.18±45.24) pg/ml, (194.24± 44.81) pg/ml, (3586±63) ng/ml, respectively; and the corresponding values in ANP group were

(6750±322)U/L, 9.33±1.76, 7.81±0.28, 3.29±0.30, (15.14±0.84) ng/ml, (349.31±94.54)pg/ml, (315.59±37.04) pg/ml, (4345±244) ng/ml, respectively; which were significantly higher than (1442±183)U/L, 4.34±0.42, 1.10±0.21, 0.88±0.08, (5.13±0.74)ng/ml, (108.74±31.03) pg/ml, (106.44±21.31) pg/ml, (2895±165) ng/ml in sham operation group (Plt;0.01 orPlt;0.05). Resistin was positively correlated with the increase of C-reactive protein, TNF-alpha, IL-1 beta and the pathologic score of pancreas, respectively (r=0.711, 0.812, 0.794, 0.812,Plt;0.01).ConclusionsResistin was correlated with the pathogenesis and development of acute pancreatitis, and may be useful to predict the severity of acute pancreatitis.

Pancreatitis; Resistin; C-reactive protein; TNF-alpha; IL-1 belta

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.013

213003 江苏常州，苏州大学附属第三医院消化科(徐克群、沈云志)；第二军医大学长海医院消化科(龚燕芳、满晓华、吴洪玉、金晶)

沈云志，Email:yunzhishen@126.com