塞来昔布联合卡介苗治疗大鼠膀胱肿瘤的实验研究

刘彦斌　米振国　杨新晶　任连生

[摘要]目的：观察联合应用塞来昔布与卡介苗治疗大鼠膀胱肿瘤的疗效，并探讨其机制。方法：选用5～6周龄雌性Wistar大白鼠40只，随机分为4组，即PBS组、塞来昔布组、卡介苗组、塞来昔布+卡介苗组。均采用膀胱灌注MNU(N-甲基亚硝基脲)制成大鼠膀胱肿瘤模型，于灌注MNU后第10周开始给予相应的药物干预治疗，于第13周处死所有大鼠，观察膀胱肿瘤的形成情况，免疫组织化学检测肿瘤组织中的CD3+、CD4+、CD8+细胞的浸润情况，TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡指数（apoptotic index,AI）。结果：联合用药组CD3+、CD4+、CD8+细胞浸润百分比及肿瘤细胞AI值与其他组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：联合应用塞来昔布和卡介苗比单纯使用卡介苗或塞来昔布能更加明显地抑制大鼠膀胱肿瘤的生长，其机制可能是通过促进免疫系统的功能和诱导肿瘤细胞凋亡增加而发挥作用的。

[关键词] 膀胱肿瘤；塞来昔布；卡介苗

[中图分类号] R737.1 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2009）05（a）-０25－０3

Effect of BCG combined with celecoxib on the animal model of bladder tumor

LIU Yanbin1,MI Zhenguo2*,YANG Xinjing1,REN Liansheng2

（1.The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China；2.Shanxi Tumor Hospital,Taiyuan 030013,China）

[Abstract] Objective: To observe the effect ofCelecoxib combined with BCG on the Wistar rats model of bladder tumor and discuss the mechanism of the therapeusis. Methods: Separated forty female 5-6 week-old Wistar rats into four groups: PBS groups, Celecoxib groups, BCG groups, Celecoxib+ BCG groups randomly. All the rats were irrigated MNU(M-methyl-N-nitrosourea) into their bladders to make of the bladder tumor models. Treatment took place on tenth week after irrigated MNU, four groups were irrigated corresponding drug into bladders; at thirteen week executed all rats, observed the development of bladder tumor, detected infiltrating condition of CD3+, CD4+, CD8+ cells in tumor tissues with immunohistochemistry, detected apoptosis condition of tumor cells with the method of TUNEL. Results: Celecoxib+ BCG groups compared with the other groups，the difference of the infiltration percentage of CD3+, CD4+, CD8+ cell and the degree of tumor cell apoptosis has statistical significance（P<0.05）. Conclusion: Combined Celecoxib and BCG can be more conspicuous inhibition of tumor growth of rat bladder than the use of celecoxib or BCG alone, The mechanism is maybe that promoting the function of immune system and increasing tumor cells apoptosis.

[Key words] Bladder tumor; Celecoxib; BCG

膀胱肿瘤是泌尿系统中最常见的肿瘤，90%以上为移行上皮细胞癌，大部分为浅表性膀胱癌,除了用手术治疗以外，还须辅以抗肿瘤药物膀胱内灌注治疗，但有一定的复发率和应用药物的副作用，其中卡介苗是主要的治疗药物。本研究采用MNU膀胱灌注诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型，用塞来昔布和卡介苗单独和联合用药，评价其疗效，以寻求更安全有效的膀胱肿瘤药物联合治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及主要试剂

5～6周龄Wistar雌性大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供；MNU由美国Sigma公司生产；冻干卡介苗购自上海生物制品研究所；塞来昔布由美国辉瑞公司生产。

1.1.2 试剂的配制

MNU溶液：用pH 6.0的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液为溶剂，将MUN配成浓度为20 mg/ml的溶液，每只大鼠用量0.1 ml。BCG溶液：50 mg/支冻干卡介苗溶于5 ml生理盐水中，每只大鼠用量0.1 ml。塞来昔布:每只大鼠用量100 mg/kg，按大鼠体重确定其用量，溶于2 ml生理盐水中。

1.2 方法

1.2.1 膀胱肿瘤大鼠模型的制备

40只大鼠造模过程：灌注前腹腔内注射0.6%的戊巴比妥钠麻醉动物，剂量为2.5 ml/kg。起效后仰卧固定，0.1%的碘伏消毒尿道外口后，用5 cm硬膜外导管导尿排空膀胱后，接上带有6号半针头的1 ml注射器按计划向膀胱内注入0.1 ml MNU溶液，每2周1次，共5次。

1.2.2 分组及处理

于第10周，将40只大鼠随机分为4组：PBS组，塞来昔布组、卡介苗组、塞来昔布+卡介苗组，每组10只。开始给予药物干预治疗，分别给予0.1 ml PBS、100 mg/kg塞来昔布、0.1 ml 卡介苗、100 mg/kg塞来昔布+0.1 ml卡介苗，PBS 与卡介苗采用膀胱灌注给药，每周1次，共3次，塞来昔布采用灌胃给药，每天1次，共3周。

1.2.3 标本处理

1.2.3.1 病理切片观察：于第13周采用断颈法处死大鼠，解剖膀胱，完整切取膀胱，于膀胱前壁剖开，观察膀胱内表面及肿瘤形成的大体情况；在病变明显处切取部分肿瘤组织，置于中性福尔马林溶液中固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，显微镜下观察。

1.2.3.2 免疫状态检测：用免疫组化法分别检测切片中肿瘤组织中CD3+、CD4+、CD8+的表达量；TUNEL法检测肿瘤组织细胞的AI值。

1.2.4 统计学处理

数据用x±s表示，所有实验数据均采用SPSS11.5软件进行处理, 用SNK法进行多个样本均数的方差分析，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 MNU诱发膀胱肿瘤情况

解剖切开膀胱发现膀胱壁增厚、苍白、菜花状新生物形成，绝大多数为多发肿瘤。HE 染色结果:移行上皮结构特征部分消失，呈弥漫分布或排列成实体性癌灶。细胞异形明显，表现为细胞大小不一，排列紊乱，极向消失，核畸形，核浆比例大，核分裂像明显。

2.2 塞来昔布及卡介苗的抑瘤作用

2.2.1免疫组化检测计数结果（表1）

各组均出现不同程度的免疫细胞浸润呈棕褐色染色（图1～3）。每个视野计数100个细胞，计数3个视野，计算阳性细胞数占细胞总数的百分率。其余3组CD3+、CD4+、CD8+细胞的浸润百分比与PBS组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。联合用药组与卡介苗组及塞来昔布组比较，免疫细胞浸润更明显（P<0.05），联合用药可以增强免疫细胞在肿瘤组织局部的作用。

2.2.2凋亡细胞检测计数结果（表1）

各组均出现不同程度的肿瘤细胞核呈棕褐色染色（图4）。其他实验组AI均明显高于PBS组（P<0.05）。且联合用药组与卡介苗组及塞来昔布组比较凋亡更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

研究发现，以卡介苗为基础的联合灌注治疗能够明显地延长膀胱癌患者的总体生存时间。卡介苗发挥抗癌作用的主要方式是通过激活免疫系统而发挥作用[1]。

近期研究表明,在浅表性膀胱癌和人类其他肿瘤的癌组织和细胞系中检测到COX-2 蛋白及分子水平都有高表达[2-4]。COX-2诱导产生的PGE2分泌增加与机体免疫抑制相关，PGE2能降低机体的抗肿瘤免疫而促进肿瘤的生长[5]。研究认为，塞来昔布抗肿瘤效应主要是通过降低PGE2水平从而增强免疫系统的功能来起作用的。

研究表明，在BCG激活的膀胱肿瘤局部免疫中，CD4+T细胞在膀胱黏膜下层的浸润是最重要的，CD4+T细胞的表达量直接关系到BCG激活的免疫系统的效能[6]。本实验结果显示，联合用药组CD3+、CD4+T细胞比单独用药组有显著的增长，其差别有统计学意义。本研究中，CD8+T细胞的表达量用药组比PBS组均减小，联合用药组减少更显著。研究表明，CD8+T细胞在用药治疗早期是升高的，但是治疗后期会下降，这与大量的CD8+T细胞作用于肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞的同时，自身也崩解、凋亡有关。塞来昔布组与PBS组比较，肿瘤免疫细胞的表达量的差异无统计学意义，这说明在无BCG激活局部免疫反应的条件下，使用塞来昔布难以充分调动机体的免疫反应，其抗肿瘤效应主要是通过抑制PGE2的产生从而提高肿瘤定向细胞毒性作用[7]。说明联合使用塞来昔布和卡介苗可以更大地激活免疫系统的反应性。

凋亡细胞指数是衡量组织中细胞凋亡发生程度的一项指标，本实验通过TUNEL法检测各组肿瘤组织的凋亡细胞，观察药物对肿瘤细胞的凋亡和生长抑制的影响。本研究中，联合用药组的AI值明显高于其他各组，差别有统计学意义。说明联合塞来昔布和卡介苗能显著增加肿瘤细胞的凋亡，抑制其分化增值。

综上所述，塞来昔布联合卡介苗治疗膀胱肿瘤，比单纯使用卡介苗及塞来昔布更有效，但要成为一种新的膀胱肿瘤的治疗方法，还需要进一步的试验和研究。

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（收稿日期：2009-03-16）