芹菜甲素对拟痴呆大鼠脑神经元保护机制的研究

朱济英　吴红卫　王明琴　高　颍　周永坤

[摘要] 目的：探讨芹菜甲素对拟老年性痴呆（AD）大鼠脑神经元的保护机制。方法：给予D-半乳糖注射和三氯化铝灌胃建立慢性中毒型痴呆大鼠模型；在制备AD模型同时用芹菜甲素灌胃；用Y型迷宫试验观察其行为学改变；用免疫组化技术检测大鼠静脉血液中超氧化歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)活性的变化；用荧光标记法测定脑细胞内游离钙离子的浓度；采用流式细胞技术、激光共聚焦技术检测神经元细胞凋亡；并分别与对照组比较，观察芹菜甲素对大鼠神经元病变、学习记忆能力的影响。结果：模型组大鼠海马和皮质具有典型的细胞凋亡特征，T-SOD活性降低，MDA含量升高；而芹菜甲素治疗组海马和皮质神经细胞凋亡数减少，T-SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论：芹菜甲素具有明显抗氧化作用和抑制神经细胞凋亡作用，其改善AD大鼠学习记忆功能可能是通过多个环节整体治疗来实现的。

[关键词] 大鼠；老年性痴呆；芹菜甲素；神经保护

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2009）05（a）-011-03

A study on the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with Alzheimers disease

ZHU Jiying1，WU Hongwei2，WANG Mingqin1，GAO Ying3，ZHOU Yongkun4

(1.The Second Affiliated Hospital, Shandong TCM University, Jinan250001，China; 2.Jinan medical insurance manage office, Jinan250002, China; 3.Jinan medical society, Jinan250031, China; 4.The first hospital attached to Shandong traditional Chinese medical University, Jinan250011, China)

[Abstract] Objective: To study the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with AD. Methods: The mice were given to D-galactolipin and chlorinate aluminium by intragastric administration to establishchronic Alzheimer's disease rat models, then Donepezil was given by intragastric administration. The behavioral abnormalities were investigated by Y type maze test. The expressions of T-SOD and MDA were measured by a immunohistochemistry technique. The performance and learning ability were observed. Results：Compared with model group, the performance records of learning and memory in Donepezil group were better (all P<0.01), the activity of T-SOD were decreased clearly (all P<0.05), and the expression of MDA was increased evidently (P<0.01). Conclusion: Donepezil has functions of neuroprotective effect, improvelearning and memory ability of mice with AD，it may be involved in the mechanisms of multi approaches.

[Key words] Mice;Alzheimer's disease;Donepezil;Neuroprotection

现代医学研究表明：AD病理改变主要为tau蛋白异常磷酸化、β-淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结、神经元颗粒空泡样变性和神经元丢失[1-2]。但病因复杂，发病环节较多，目前认为与神经递质紊乱、基因突变、氧化应激和自由基损伤、钙离子超载、免疫/炎症反应和神经细胞凋亡等多因素有关[3]。本实验在建立注射D-半乳糖(D-gal)致痴呆大鼠的模型基础上,再给予AlCl3连续灌胃造成拟AD复合模型,采用对照研究的方法观察实验动物的行为学、T-SOD、 MDA的活性、细胞内游离钙离子浓度的变化及神经细胞形态学和细胞凋亡的定量分析，探讨神经元凋亡在AD发病过程中的意义及芹菜甲素的防治作用机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 动物及分组清洁级雌雄各半SD大鼠80只（购自中国军事医学科学实验动物中心），月龄2～3个月，质量（280±50）g,通过行为学实验筛选合格的大鼠随机分为：空白对照组、模型组、脑复康组、芹菜甲素组。大鼠用标准实验动物饲料喂养,其中微量元素含量均可满足动物正常生理需求。室温（23±2）℃。

1.1.2主要仪器及试剂结晶三氯化铝（沈阳市试剂三厂，批号：20001201)，D-半乳糖(上海试剂二厂，批号：990927。), 芹菜甲素（太原兴远生化有限公司），T-SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程公司，批号：20001112、20001008）；Fluostar多功能微孔分析仪(德国BMG公司)；流式细胞仪（FACS can型,美国BD公司生产，由济南军区总医院提供）。

1.2方法

1.2.1模型制备及药物干预适应性饲养1 周后，空白对照组正常饲养，模型组、脑复康组及芹菜甲素组给予 D-半乳糖 50 mg/（kg·d），颈背部皮下注射，并三氯化铝50 mg/（kg·d）灌胃，连续10周造成亚急性衰老复合模型鼠。造模的同时，芹菜甲素组按 20 mg/（kg·d）、脑复康组按200 mg/（kg·d），灌胃给予，每日1次，连续10周。

1.2.2 Y型迷宫试验利用Y型电迷宫，参照文献[4]方法训练于第10周后开始行迷宫测试，先将大鼠放入迷宫中适应3～5 min，然后无规则次序变换安全区，训练大鼠对安全方位及灯光刺激的辨别能力。大鼠受电击逃到安全区后以大鼠所在区作为下一次测试的起始位置，每日在固定时间（下午3∶00～5∶00）对每只大鼠进行15次训练,连续5 d。以大鼠在足底通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应；记录正确次数、正确率及跑至安全区所用时间作为判定大鼠学习记忆的标准。

1.2.3测试后处理于迷宫测试完成后末次给药后12 h，经心室腔穿刺取血。取血后立即断头取脑，去除血液及脑膜，置于液氮罐中保存备用。

1.2.4SOD和MDA测定血液经2%的EDTA抗凝离心后取血清，分别按试剂盒说明书进行测定。

1.2.5观察皮质和海马病理学变化分组取大脑，10%中性缓冲液福尔马林固定4 h以上，石蜡包埋。冠状连续切片8张（4 μm），HE染色, 免疫组化采用SP法，光镜下观察皮质、海马。

1.2.6神经细细胞内游离钙离子浓度的测定剥离脑皮质和海马组织，分别置于DMEM培养液中剪碎，用吸管吹打分散细胞，经300目铜网过滤，离心后弃上清，0.01 mol/L PBS洗涤,台盼蓝排斥试验检查，细胞成活率达90%。细胞悬液在37℃水浴中预温5 min，加入Fura 2·AM-1使终浓度为5 μmol/L，于37℃水浴中恒温振荡40 min进行负载。后以D Hank's液洗涤，并制成1×106/ml的单细胞悬液。采用Fluostar多功能微孔分析仪，激发波长340 nm和380 nm，发射波长505 nm，测定荧光强度，并按文献公式计算出神细细胞内游离钙离子。

1.2.7流式细胞仪检测细胞凋亡的定量分析[5-6]剥离脑皮质和海马组织，在冷70%乙醇中固定。用吸管吹打分散细胞，加入0.25%的胰蛋白酶液,37℃消化30 min,经300目铜网过滤，0.01 mol/L PBS洗涤并制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml。DAB显色，采用TUNEL检测法。将所得数据经Macintosh 650型计算机上用CellQuestPlot软件(BD公司生产)分析数据，分析细胞的凋亡百分率（细胞凋亡率=凋亡细胞/总细胞数×100%）。细胞核棕黄色为凋亡细胞。

1.2.8 统计学处理所有实验数据用SPSS 10.0统计软件处理，采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，各实验组均数间的两两比较，若方差齐则采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane's T2检验。

2结果

2.1 各组大鼠学习记忆成绩的比较见表1。

2．2 芹菜甲素对拟痴呆大鼠血清中SOD及MDA的影响见表2。

2.3芹菜甲素对拟痴呆大鼠脑组织形态学的影响

HE染色(免疫组化×400)可见空白对照组大鼠皮质、海马区神经细胞数目多，排列紧密、均匀而整齐，胞核呈圆形或椭圆形，染色质均匀，核仁明显；模型组和脑复康组均见不同程度的神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱，胞核深染、固缩，有核仁消失，胞浆周围发现空晕，胞间距较大，并可见不规则形胶质细胞及散在的胶质细胞增生小结，仅见少量正常神经细胞；芹菜甲素组正常神经细胞数目较多，排列较密，胞核圆或椭圆形，染色质丰富，核仁清晰，少见固缩变性的神经细胞。

2.4芹菜甲素对拟痴呆大鼠神经细细胞内游离钙离子浓度的影响

模型组大鼠神经细细胞内游离钙离子浓度较空白对照组升高(P<0.05)；芹菜甲素组游离钙离子浓度降低(P<0.05)。

2.5芹菜甲素对拟痴呆大鼠神经细胞凋亡的影响见表3。

在DNA直方图上，模型组于G0/G1峰左侧出现了一个明显的亚二倍体峰（细胞凋亡峰），表明DNA的降解增多，芹菜甲素组的DNA直方图中也可见到凋亡峰，但显著低于模型组，空白对照组则未见明显的凋亡峰。

3讨论

芹菜甲素为伞形科植物旱芹的干燥成熟果实粉末状提取物的有效成分。铝作为一种神经毒素，可能是导致AD 的病因之一。铝可进入脑内取代钙和镁离子，同氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸的羧基结合形成谷氨铝盐或精氨酸铝盐的稳定复合物而沉积于脑内，引起tau蛋白异常磷酸化反应，形成神经元缠结，促进A β的形成而产生老年斑，破坏血、脑脊液屏障及改变脑细胞内溶酶体活性,使自由基生成过多等，最终导致神经元死亡，患者出现记忆、语言、认知功能等进行性智能功能丧失和近记忆力障碍[7]。因为AD的是多成因发病和错综复杂的病理过程，笔者在使用D-半乳糖致亚急性衰老提供的一个老化背景的基础上，再予铝剂模拟AD，以形成多因素复合实验性AD大鼠模型。这样的复合模型可能较以前的单因素AD动物模型更贴近AD复杂的病理变化过程，尤其是更适合用于探讨药物多靶点作用机制和有效药物筛选的研究模型[8]。通过实验提示，该模型在学习记忆、细胞凋亡等方面都表现出广泛的类AD的病理改变。

随年龄的增长，氧自由基的清除能力退化，在体内大量聚积，破坏细胞膜，可诱发细胞凋亡[9]。本实验在应用芹菜甲素后，治疗组较模型组SOD活性升高,MDA 含量降低，表明可能通过减轻脂质过氧化反应，保护酶的活性，达到抗氧化作用，直接或间接清除D-半乳糖和三氯化铝引起的自由基产生增多造成的损害，避免抗氧化性物质消耗导致的脑组织损伤，也从另一个侧面验证了SOD的活性和MDA含量的改变在AD发病中的作用。

随着老龄化的发生，细胞内的Ca2+调控能力逐渐衰退，细胞膜上钙通道开放和细胞内钙库的释放而引起胞内Ca2+呈渐进性增加，钙稳态被破坏[10]。钙超载使兴奋性氨基酸过度释放，产生自由基造成线粒体能量代谢障碍和神经细胞骨架破坏，最终导致神经元死亡[11]。因此阻断细胞钙内流，维持细胞内钙稳态，也是保护细胞正常功能的一个重要手段之一[12]。本实验结果显示，芹菜甲素可以降低拟AD大鼠细胞内的游离钙离子浓度，通过维持细胞内钙稳态，抑制了伴随脑老化产生的钙超载，对神经细胞起到了保护作用。

凋亡是一种细胞主动参与的自毁过程，与细胞坏死有根本区别，它与细胞的增殖共同维持机体正常生长发育和内环境的稳定。在细胞凋亡的诸多诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡，细胞凋亡可能是机体氧化和抗氧化失衡的结果之一。细胞发生凋亡时,出现明显的核固缩、断裂、凝聚,形成凋亡小体[13]。

本实验研究结果显示通过激光共聚焦的形态学检测和在流式细胞仪DNA定量分析图谱上出现显著的凋亡峰，结合芹菜甲素能提SOD 活性, 降低脂质过氧化产物丙二醛含量, 减轻氧化应激，清除自由基, 维持细胞内钙稳态，抑制神经元凋亡，抗脑萎缩多位点作用, 提示芹菜甲素具有较好的抑制AD发生的作用，也为开发中药及其提取物从多环节防治AD提供了客观的理论依据。

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(收稿日期：2009-02-10)