DNA的提取及鉴定

赵连梅 张春青

摘要由于DNA容易变性,为了获得和天然DNA结构相似的大分子DNA,必须严格控制实验条件,同时还要抑制脱氧核糖核酸酶的作用。在提取液中加入整合剂柠檬酸钠和EDTA,使之与脱氧核糖核酸酶的辅因子Ca2+和Mg2+结合,使核酸酶丧失活性。十二烷基磺酸钠(也称SDS)为去污剂,可以破坏细胞膜,也可以使核酸酶丧失活性。

关键词DNAEDTASDS

中图分类号:Q78文献标识码:A

DNA以核蛋白形式存在于细胞核中,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及链霉蛋白酶E的应用使这两个原则得到了保证。蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为广谱蛋白质,其重要特性是能在SDS(十二烷基硫酸钠)和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,蛋白酶E可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。加入氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量采取温和条件,以保证得到较长的DNA。

1材料与仪器

1.1 材料

(1)鸡肝。

(2)氯仿/异戊醇=24:1。

(3)75%乙醇、90%乙醇、无水乙醇。

(4)1譙SC溶液:0.15mol/L氯化钠—0.015mol/L柠檬酸钠溶液,pH7.0。

(5)0.15mol/L氯化钠—0.1mol/LNa2EDTA溶液,pH8.0。

(6)5%SDS溶液:把5gSDS溶于100 mL45%的乙醇中。

(7)二苯胺试剂:将1g纯的二苯胺溶于98 mL的冰乙酸中,再加入2 mL浓H2SO4,此溶液须新鲜配制。

(8)DNA溶液:把100mg脱氧核糖核酸溶解于100 mL蒸馏水中。

1.2 仪器

(1)组织捣碎匀浆机。

(2)离心机。

(3)天平。

2 方法

2.1 DNA的提取

(1)称取80g新鲜的鸡肝,剪成小块,放入盛有大约150ml预冷的1譙SC溶液的烧杯中洗大约5分钟,倒掉缓冲液,再加入大约150ml预冷的1譙SC溶液洗2～3次,使血量减少。

(2)把洗净的鸡肝放入组织捣碎匀浆机中,加入约2倍体积1譙SC溶液匀浆1～2分钟。

(3)取匀浆液20ml,在3500r/min下离心10min,倒掉上清液(注:记录上清液的体积)。

(4)将离心后所得的沉淀(20 ml减去上清液的体积即为沉淀量)均匀悬浮于5倍体积的0.15mol/L氯化钠—0.1mol/LNa2EDTA溶液中,边搅拌边滴加5%SDS溶液,直到SDS的最终浓度达1%为止。

(5)在剧烈搅拌下加入已经磨碎的固体氯化钠使其最终浓度达到1mol/L,继续搅拌30分钟直到氯化钠完全溶解为止。

(6)把上述混合液倒入一个试剂瓶内,加入等体积氯仿/异戊醇混合液,在室温下激烈振荡20分钟。

(7)在3000r/min转速下,将上述悬浊液离心30min。

(8)离心后,小心吸取凝聚的蛋白质上部的水层(DNA在水相),蛋白质在水相和有机相之间,把吸出的上层水相倒入一个250ml的烧杯中。

(9)用一支干净的玻璃棒慢慢搅动下缓缓加入2倍体积预冷的95%乙醇。乙醇加入后,沿一个方向连续的搅拌,使其充分混合,以便使丝状DNA缠绕于玻璃棒上。

(10)将绕出的DNA放入75%的乙醇中洗一次,然后放入95%的乙醇中洗一次,最后再放入无水乙醇中洗一次。

(11)将提取的DNA样品转入试管中,加入适量的水溶解备用(记下总体积)。

2.2DNA的鉴定

取两支试管,分别加入5毫升的DNA标准溶液和2毫升鸡肝DNA溶液,再各加入2毫升二苯胺试剂,混合均匀,在沸水浴中加热10分钟,将试管冷却。冷却后加入二苯胺的试管溶液均变蓝(深蓝),说明含大量DNA。溶液颜色的深浅与DNA的含量有关。

3结论与分析

(1)几乎所有的细胞中都含有DNA。但是有些组织细胞中DNA的含量很少,不适合作为制备DNA的材料。此外,在有些组织中,脱氧核糖核酸酶的活性很高,所以在这些组织细胞中的大分子DNA都已经断裂为小的碎片。因此,从组织细胞中制备DNA选择DNA含量多而脱氧核糖核酸酶活性低的组织。具备这些最好的组织是胸腺、淋巴组织,脾脏、肝也是理想的材料。本实验选用的组织是新鲜的鸡肝。实验证明,新鲜的鸡肝提取的DNA量多、链长且不易断裂;将刚取出的新鲜鸡肝急速冷冻后再提取的DNA的效果也可以,但不如新鲜的鸡肝提取出的DNA的量多;不新鲜的冷冻过的鸡肝提取的DNA量少、链短且易断裂。

(2)细胞内核酸都是与蛋白质结合而呈核蛋白的形式,所以在制备核酸时,先设法破碎细胞,然后再将蛋白质与核算相分离。在提取液中加入整合剂柠檬酸钠和EDTA(乙二胺四乙酸),使之与脱氧核糖核酸酶的辅因子Ca2+和Mg2+结合,使核酸酶丧失活性。十二烷基磺酸钠(也称SDS)为去污剂,可以破坏细胞膜,也可以使核酸酶丧失活性,本实验采用较高浓度的SDS,与蛋白酶K处理细胞以促使细胞及细胞核破裂。

(3)乙醇对酶的活性有抑制作用,所以在提取DNA时要尽量去除乙醇,以免影响蛋白酶K的活性。因此在提取DNA时,首先要进行离心,将含有较多乙醇的上清液除去。将离心后所得的沉淀均匀悬浮于5倍体积的0.15mol/L氯化钠—0.1mol/LNa2EDTA溶液中,在剧烈搅拌下加入已经磨碎的固体氯化钠使其最终浓度达到1mol/L,继续搅拌30分钟直到氯化钠完全溶解为止。一方面溶解稀释残余的乙醇,另一方面为肝细胞提供近似的生理溶液环境,取得了较理想的效果。

(4)脱氧核糖核酸和蛋白质结合形成的复合物成为脱氧核糖核蛋白(简称DNP),DNP溶于高离子强度的溶液中,但不溶于低离子强度(0.05～0.25mol/L)的溶液中。利用这一性质,在提取的最初阶段,首先把组织细胞放于柠檬酸钠的等渗盐溶液中匀浆(pH为7.0),此时,大多数其他的大分子物质如核糖核蛋白(RNP)处于溶解状态,而脱氧核糖核蛋白(DNP)不溶,分离沉淀物,将其溶解于1 mol/L的盐中。加入氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质,向抽提液中加入乙醇可沉淀出DNA。

(5)DNA的鉴定采用二苯胺鉴定法。DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解,产生2-脱氧核糖并形成%r-羟基-%-酮基戊酸,后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物,其反应如下图。

蓝色化合物在595nm处有最大吸收,且DNA在40%eg ~400%eg范围内时,吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。