分子标记及其在核桃种质资源研究中的应用

陈 霞 陈少瑜 陆 斌 李文祥 张 雨

摘要介绍了分子标记技术的类型,以及目前常用的几种分子标记技术(RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR等)的基本原理、特点,综述了分子标记技术在核桃种质资源研究中的应用情况,并对目前分子标记研究存在的问题及前景作了分析。

关键词分子标记;核桃;种质资源;应用

中图分类号Q819文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)14-0347-04

分子标记也称为DNA分子遗传标记,或DNA标记,是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后,近年来被广泛应用的一种新的遗传标记。分子标记从分子水平反映生物个体间或种群间具有差异特征的DNA片段,直接反映基因组DNA间的差异,从而为解释各物种间的亲缘关系奠定了技术理论基础[1]。DNA标记能对各个发育时期的个体、组织、器官进行检测,不受发育阶段及环境的影响,且遗传稳定、数量丰富。DNA分子标记对生物的影响表现为中性,有些标记为共显性,且对选择隐性基因控制的性状十分有利。至DNA标记诞生到现在,发展迅猛,日臻成熟。目前,DNA标记被广泛地应用于植物遗传育种、基因定位、基因克隆以及分子辅助选择等研究领域。

我国是核桃属(Juglans)植物分布中心之一,原产于我国的有5个种,其中核桃(J. regia L.)和铁核桃(J. siggillata L.)具有极大的商业坚果栽培价值[2-5]。随着核桃属作物大规模商业化的快速发展,以及品种选育、鉴定、推广及种质资源收集和保护工作的深入开展,形态描述、地理来源以及同工酶等方法由于自身存在局限性而难以满足核桃属植物研究和开发的需要,分子标记技术将成为上述工作的有效工具。

1分子标记的类型

DNA分子标记大多以电泳谱带的形式体现,大致可分为两大类[1]。第1类是非PCR依赖的分子标记(基于Southern杂交的分子标记),包括限制性片段长度多态性标记(restriction fragment length polymorphism DNA,RFLP)、原位杂交(in situ hybridization)等;第2类DNA标记基于PCR技术,主要包括随机扩增多态性DNA标记(random amplification polym-orphism DNA,RAPD)、DNA扩增指纹印迹(DNA amplifi-cation fingerprinting,DNA)、简单序列重复标记(Simple seq-uence repeat,SSR)、随机引物聚合酶链反应(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)以及扩增片段长度多态性标记(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等。

也有分为5类的划分法,即在前2类的基础上增添后3类。第3类以重复序列为基础的分子标记,包括卫星DNA(satellite DNA)、微卫星DNA(microsatwllite DNA)、小卫星DNA以及简单重复序列等;第4类是以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术,如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP);第5类是以mRNA为基础的分子标记技术,包括差异显示(differental display,DD)、逆转录PCR、表达顺序标签(expressed sequence taqs,EST)等[6]。由此可见,各类之间也存在着交叉,如第3类中的微卫星DNA也可以归于第2类以PCR为基础的分子标记技术。

2几种常用分子标记的原理和特点

2.1RFLP(Restriction Fragment length Polymorphsm)

RFLP即限制性片段长度多态性,它作为遗传工具是由Grozdicker于1974年创立,Botesin于1980年再次提出,是最早应用的分子标记技术[6,7]。DNA中特定限制性酶切位点上碱基对的改变及酶切位点之间的分子重排事件(如缺失、倒位、易位等)是产生RFLP的分子基础。其基本原理是由限制性内切酶酶解样品DAN,遗传组成不同的个体间的DNA可产生大小不同的片段,经电泳后转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜等支持物上,通过与经过放射性同位素或者非放射性物质标记的特定DNA片段(探针)杂交,最后通过放射自显影或酶学检测不同材料对特定探针的多态性。该标记实验结果稳定可靠,在遗传上呈共显性;不足在于实验成本较高,DNA所需量较大,实验操作复杂,检测周期长,检测效率低,此外同位素探针容易造成环境污染。

2.2RAPD(Random Amplifiled Polymorphic DNA)

为克服RFLP技术上的缺点,Williams等[8]于1990年建立了随机扩增多态DNA(RAPD)技术。RAPD基本原理是利用1个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来研究DNA多态性。较之RFLP、RAPD技术简单,检测速度快,DNA用量少,实验设备简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖种属特异性和基因组结构,1套RAPD引物可以用于分析不同生物基因组,用1个引物就可扩增出许多片段,且不需要同位素,安全性好;但RAPD技术受诸多因素影响,稳定性和重复性较差[9],呈显性标记而不能区分杂合子和纯合子。

2.3AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP扩增片段长度多态型,是1993年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos发明的一种DNA分子标记新技术[10],是在PCR技术和RFLP标记技术的基础上产生的。用限制性内切酶双酶切基因组DNA,形成分子量大小不等的随机限制性片段,再在片段两端接上特定接头,通过接头序列和PCR引物3′末端的识别后,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环扩增,最终利用聚丙烯酰胺电泳分子筛作用将这些特异的限制性片段分离开来。AFLP在技术上是RAPD和PFLP的结合,既具RFLP的可靠性,又有RAPD的灵敏性,是分子标记技术重大突破,目前被认为是一种十分理想、有效的分子标技术;缺点是操作技术较复杂,DNA要求纯度高,实验成本相应增加。

2.4SSR(Simple Sequence Repeats)和ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)

1991年,Moore等在PCR技术的基础上创立了SSR(简单重复序列)标记技术[11]。SSR是一类由几个(多为1～5个)碱基串联重复而成的DNA序列,其中最常见是双核苷酸重复即(CA)n和(TG)n,在植物基因中(AT)n最多。每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目10～60个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致SSR长度的高度变异性,这一变异性正是SSR标记产生的基础。SSR标记技术根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段。核心序列重复次数不同,从而扩增出不同长度的PCR产物,这是检测DNA多态性的一种有效方法。

在SSR标记中,采用PCR反应必须知道扩增DNA片段两侧序列,多数情况下某些序列本身或其旁侧序列并不清楚,且由于SSR引物具有物种特异性,引物设计费时耗力,要检测多个基因座是不现实的,这就限制了PCR技术的应用。

1994年Zietkiewicz等对SSR技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸技术[12],即简单重复间区(ISSR)或以微卫星为引物的PCR技术,可以克服上述SSR的障碍。他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致锚定微卫星引物间的基因节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR或ASSR。在所用的两端引物中,一个是锚定引物,另一个是随机引物。

SSR和ISSR与上述几类标记相比,具有稳定可靠、操作简单等特点,两者都是以重复序列和PCR扩增为基础,被列为第2代分子标记技术。

3分子标记技术在核桃种质资源研究中的应用

随着分子标记技术的发展与日趋成熟,其已经广泛应用于果树研究中[13-15],分子标记技术在核桃种质资源研究中的应用主要有以下几方面。

3.1品种起源鉴定与分类

核桃起源问题一直是许多学者较有争议的问题,也为此做了一些探索研究[16],而正确地分类是搞清起源问题的关键。传统的植物分类主要采用形态指标,但形态指标容易受外界环境的影响而发生饰变,从而导致分类偏差。由于遗传变异不仅表现在外部形态、蛋白质分子结构等方面,DAN非编码区域的变异对于生物的遗传和进化也起着重要作用,故在分类方面,借助分子标记技术可以较全面地对研究对象进行比较分析,提高分类的准确性和可靠性。

1998年,Nicese等[17]用RAPD标记分析了19个核桃品种的遗传关系,聚类分析结果显示与经典的分类结果一致,表明RAPD标记能准确反映彼此的系谱关系,首次为核桃的育种及种质资源分析奠定了基础。吴燕民等[18]用RAPD法对麻核桃的起源与分类地位进行了分析,指出核桃揪×核桃的天然杂交是麻核桃形成的主要机制;在麻核桃形成过程中,核桃揪的遗传贡献率大于核桃;在胡桃属分类中,麻核桃应归为核桃锹组,这与传统分类学的结果一致。吴燕民等[19]用RAPD技术对核桃属内9个种及近缘属的2个种进行了基因组DNA多态性分析,结果表明,铁核桃为核桃属中一个独立种;核桃属内组间和种间亲缘关系与经典分类学的结果完全一致。刘晓丽[20]利用SSR分子标记技术对新疆伊犁野核桃、喀什实生核桃及部分栽培品种的遗传结构进行分析,初步提出伊犁野核桃、喀什实生核桃和栽培品种的亲缘演化关系图,为“我国是世界栽培核桃的起源中心之一”[21]的论断进一步提供了分子证据,并为栽培核桃品种的进一步选育提供分子依据。

3.2遗传多样性分析

遗传多样性即基因多样性,体现在分子、细胞和个体3个水平上,是生命进化和物种分化的基础。一个物种的遗传变异愈丰富,它对生存环境的适应能力便愈强;而一个物种的适应能力愈强,则它的进化潜力也愈大。对核桃各种属的遗传多样性研究,有利于对核桃种质资源的保护并为核桃育种提供一定的理论依据。

奇异核桃Paradox是美国北加州黑核桃与普通核桃(J.hindsii×J. regia)的杂种后代的统称,是加州核桃产业的重要砧木。为了搞清楚Paradox的遗传背景,Daniel Potter等[22]对5种北美黑核桃进行了核DNA和叶绿体DAN的3个非编码区的ITS序列分析,并对27个Paradox居群作了分子检测,结果显示,所采用的Paradox砧木的基因中有很大部分是来自J. hindsii以外的其他种。徐郑等[23]运用RAPD技术对川西高原及秦巴山区核桃作了研究,指出前者遗传多样性高于后者。陈良华等[24]用AFLP技术对四川省的3个野生核桃种群和1个野生铁核桃种群共46个品种进行了遗传多样性分析,得出铁核桃群体遗传多样性水平略高于核桃群体,且群体内的遗传多样性大于群体间。郝艳宾等[25]运用已开发的黑核桃SSR引物探索出适合核桃属SSR标记的引物,得出有72.78%的黑核桃SSR引物能应用于核桃属,能进一步用于核桃属的遗传多样性研究。并用SSR技术对我国核桃组种质资源进行了遗传多样性分析[26],认为我国核桃栽培实生群可划分为新疆核桃、华北核桃和西藏核桃三大相互独立的地理生态类型,而秦巴山地核桃应分别属于华北和新疆2个地理生态型。李同和[27]利用AFLP银染技术,对四川省3个核桃居群和1个铁核桃居群的共46个样品进行遗传多样性分析、居群遗传结构分析及种属关系探讨。指出铁核桃居群遗传多样性水平略高于核桃居群,各种多态性指数表明居群内的遗传多样性大于居群间,这为核桃种质资源的保护和育种提供一定的理论依据。在对四川西部核桃属植物遗传多样性的研究过程中,王宝庆[28]的研究结果与李同和的较一致。王滑等[29]也用SSR标记技术对中国核桃的8个天然居群进行遗传多样性分析,统计分析得出云南丽江铁核桃居群的遗传多样性最高,四川黑水核桃居群最低,同时得出8个居群间的遗传距离与其地理距离有显著的相关性。

3.3重要农艺性状的连锁标记

早实性是核桃生产的瓶颈性作用性状,也是近年来核桃研究最多的一个农艺性状。核桃童期的长短取决于该物种本身的特性,受基因控制。普通核桃中的晚实类群的童期长达4～8年,极大地限制了核桃的栽培和育种。研究核桃早实基因的遗传规律,寻找与其相连锁的DNA分子标记,从而克隆出核桃早实基因,这对核桃育种、栽培实践和揭示木本植物童期发育的机理都有重要意义。

张虎平等[30]先利用表观性状将参试核桃分为早实和晚实2个集群,再利用RAPD技术筛选出一个与早实性状相关的稳定的标记,最后将其成功地转换为特异性的SCAR标记。杨克强等[31]用BSA法获得了与核桃早实性状相关的RAPD标记OPB-08958,并对早实和晚实核桃品种进行了DNA扩增,只在早实品种的扩增产物中出现此条带。并测出该标记序列为核桃基因组所独有,与核桃早实基因之间的遗传距离为1.99cm[32]。此外,Nadia Goue等[33]用RACE技术(cDAN末端快速扩增技术)来隔离核桃CDKA基因的完整序列,并对该基因的结构与功能进行了首次描述,据其报道该基因与核桃木径向生长和出材量有关。

3.4构建指纹图谱

传统的植物学分类的理论基础都建立于性状分析,这些性状大多是与环境紧密相关的表现型,加之核桃苗期各品种之间的性状差异较小,在进行苗木选购时难免出现品种混杂、以次充好的现象,不利于核桃良种的推广。指纹图谱是指能够反映生物个体间差异的电泳图谱。由于它具有类似人类指纹的高度个体特异性和稳定可靠性,故被称为“指纹图谱”。分子标记出现后,DNA被迅速用作指纹图谱分析,称作DNA指纹图谱。运用DAN指纹图谱能进行品种的真实性和纯度鉴定,确定品种的亲缘关系,以及用于新品种登记和品种知识产权保护等。

陈良华等[34]运用RAPD技术对核桃与铁核桃特征性条带进行标记,筛选出的引物D6能扩增出核桃种的一条250bp的特异带,铁核桃中没有,得出D6-250可能为核桃与铁核桃之间的特异性分子标记,为核桃与铁核桃种质鉴定提供一定的理论依据。陈少瑜等[35]运用RAPD和ISSR标记分别对云南核桃的11个主要栽培品种进行遗传多样性分析,并构建这11个品种的指纹图谱。王红霞[36]利用AFLP分子标记技术对普通核桃131份材料的遗传多样性进行分析,构建了核桃的核心种质,并对核桃种间的亲缘关系进行研究,将核桃属8个种分为4个组:黑核桃组,野核桃、吉宝核桃和心形核桃组,铁核桃、核桃楸和河北核桃组,普通核桃组。陈静[37]在建立适合核桃的AFLP银染技术体系的基础上,构建了58份核桃供试样品的指纹图谱,并对其遗传多样性进行了分析,揭示了供试材料间遗传背景的相似性及复杂性,为核桃的品种鉴定和产权保护提供了理论依据。

4应用前景

近年来,在人类基因组研究的推动下,NDA分子标记的研究与利用得到迅速发展,并广泛应用于农业基础与实践。目前,果树分子标记的研究已取得实质性进展,并应用到果树育种的各个方向。核桃为多年生作物,性周期长,自交结实率低,个体杂合度高,植株高大,给普通遗传学的研究带来困难,由于对亲本复杂的遗传背景缺乏了解,果树育种中的盲目性很大。分子标记是辅助核桃遗传育种研究的有力手段,将大大加快核桃育种的进程,缩短育种年限,提高育种效率。

值得指出的是,在真核生物的DNA分子上同时存在着“Junk DAN”、内含子和外显子3种组成,虽然内含子也是基因的组成部分,但却在RNA离开细胞核时,即转录前被剪除,只有外显子能通过转录和翻译等步骤形成蛋白质。笔者认为,目前开发的DAN分子标记技术对这3种组成不能进行识别标记,也就是说呈现的多态性标记并不能全部转化成为生物的性状,其中存在着对生产无指导意义的部分。因此,DNA标记技术的发展有待于对DAN分子组成部分功能的研究。

分子标记技术在实际生产中应满足稳定性好、分辨率高、多态性强和效率高等要求。充分考虑成本与效益等限制问题,该问题的解决有赖于分子生物学和其他相关学科的相互渗透和相关人员的更紧密合作。随着NDA分子标记的广泛应用、分子生物学及相关边缘学科理论与技术的迅速发展,必然不断开发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记。随着NDA提取、纯化的程序化,电泳分析的自动化,数据处理计算机化及信息网络化的进一步发展,DNA分子标记技术将在生产中发挥越来越大的作用。

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