酸奶冷藏过程的酸度变化与发酵菌２种酶活性的关系研究

林召丰　王子龙　王志耕

摘要 以实验室保存的3株保加利亚乳杆菌和3株嗜热链球菌制作酸奶，研究蛋白酶、β-半乳糖苷酶和酸度在酸奶冷藏过程中的变化规律和相关性。结果表明，在酸奶冷藏过程中，酸度值与蛋白酶活力总体呈上升趋势，但蛋白酶活力变化不呈规律性，β-半乳糖苷酶活力总体呈下降趋势。酸度与蛋白酶呈正相关，酸度与β-半乳糖苷酶呈负相关。

关键词 酸奶；酸度；β-半乳糖苷酶；蛋白酶

中图分类号 TU252.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）05-0212-02

酸奶是牛乳经乳酸菌发酵而制得的乳制品。保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.thermophilus）是酸奶生产中常用的发酵剂菌种[1-3]。不同的菌株之间产酸能力有所不同，产酸能力是酸奶生产用菌种筛选的重要考量指标，一般以产酸能力中等，同时前产酸力较强，后产酸较弱为优良菌种筛选标准。目前关于发酵菌的产酸特性、β-半乳糖苷酶的酶学特性的研究已有不少报道，但关于乳酸菌蛋白酶的研究工作开展不多，而酸乳冷藏过程中的产酸特性与β-半乳糖苷酶和蛋白酶关系的研究很少。笔者以实验室保存的6株乳酸菌制得的酸奶为基础，研究酸度、β-半乳糖苷酶和蛋白酶在酸乳冷藏过程中的变化规律及相互关系，探讨乳酸菌活动过程中的产酸机理，以期为酸乳生产试验和产品研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。供试菌种为实验室保藏的保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜热链球菌（S.thermophilus0602，S.thermophilus0606，S.thermophil us0607）。

1.1.2 培养基。牛奶培养基：10%脱脂奶粉于121℃加热15min。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂。三氯乙酸（TCA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、邻苯二甲醛（OPA）、β-巯基乙醇、硼酸钠、甲醇、0.5%酚酞酒精指示剂、0.1moL/L NaOH、溶菌酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、ONP、ONPG。

1.2.2 主要仪器设备。Tu-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、HH-S型电热恒温水浴锅（江苏国胜实验仪器厂）、BECKMAN型高速冷冻离心机（美国）、SW-CJ-1F型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司）和KQ3200DE型数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酸奶制备。以灭过菌的10%的脱脂牛奶为培养基，按3%接种量分别接入保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜热链球菌（S.thermophilus 0602，S.thermophilus0606，S.thermophilus0607）。按此方法制成的酸奶分别定为“酸乳L.b01”、“酸乳L.b02”、“酸乳L.b06”、“酸乳S.t02”、“酸乳S.t06”、“酸乳S.t07”。

1.3.2 酸度测定。采用酸碱滴定法。用标定过的浓度为0.1 moL/L的氢氧化钠标准溶液滴定，求出酸度。同一样品，至少连测3 次，取平均值[5]。

1.3.3 β-半乳糖苷酶的测定。将酸奶制品溶于冷的1% EDTA（pH值为12，4℃）溶液中（每1g酸奶溶于20mg EDTA），4℃、15 000rpm离心10min得菌体沉淀，将菌体细胞悬浮于磷酸盐缓冲液（pH值为7.0，0.1moL/L KH2PO4、5moL/L Mg SO4，0.1moL/L MnCl2）中，用0.2%的溶菌酶和冻融法进行细胞破壁[6]。破壁之后将样品离心，去除细胞残骸和未破壁细胞，得到β-半乳糖苷酶液。采用ONPG为酶作用底物，生成有色产物ONP，通过比色法测定[7]。

1.3.4 蛋白酶的测定。用蛋白水解力（总游离氨基酸量）反映蛋白酶活力，蛋白水解力测定采用OPA试剂法[8]。

1.3.5 统计方法。利用Excel软件和SAS8.2软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中的酸度变化

由表1可见，不同乳酸菌种发酵的酸奶酸度值间存在差异，酸度值随冷藏天数的增加呈上升趋势。通过SAS的ANOVA过程对表1的数据进行分析，结果表明，冷藏15d时，L.b06酸乳的酸度值高于S.t02、S.t06、S.t07、L.b01、L.b02酸乳的酸度值。但在冷藏至11d时发生了后酸化现象，S.t02、S.t06的产酸能力处于中等水平，后期产酸比较缓慢，未发生后酸化现象，适宜做优良的产酸发酵剂。

2.2 不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中β-半乳糖苷酶活力变化

由表2可见，不同乳酸菌种发酵的酸奶产生的β-半乳糖苷酶值间存在差异，β-半乳糖苷酶值随冷藏天数的增加总体呈下降趋势，并且β-半乳糖苷酶在冷藏过程中的活力比较小，除酸乳S.t02、S.t06、L.b01在开始有所上升随后呈下降趋势外，其他酸乳均呈下降趋势。通过SAS的ANOVA过程对表2的数据进行分析，结果表明，冷藏到15d时，酸乳S.t02、S.t06产生的β-半乳糖苷酶值明显高于酸乳S.t07、L.b06、L.b01、L.b02产生的β-半乳糖苷酶值。

2.3 不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中的蛋白酶活力变化

由表3可见，不同乳酸菌种发酵的酸奶产生的蛋白酶值间存在差异，蛋白酶值随冷藏天数的增加总体呈上升趋势，但变化并不呈一定的规律性。通过SAS的ANOVA过程对表3的数据进行分析，结果表明，冷藏到15d时，酸乳S.t02产生的蛋白酶值明显高于酸乳S.t06、S.t07、L.b06、L.b01、L.b02产生的蛋白酶值，S.t06产生的蛋白酶值高于酸乳S.t07、L.b01产生的蛋白酶值。

2.4 不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中的酸度与β-半乳糖苷酶和蛋白酶活力的相关性

从表4可见，冷藏到15d时，酸度值与β-半乳糖苷酶活力呈负相关，酸度值与蛋白酶活力呈正相关。其中S.t02的酸度值与蛋白酶活力呈显著正相关（P＜0.05），S.t07的酸度值与β-半乳糖苷酶活力呈显著负相关（P＜0.05），S.t07的酸度值与蛋白酶活力呈极显著正相关（P＜0.01），L.b06的酸度值与β-半乳糖苷酶活力呈极显著负相关（P＜0.01），L.b02的酸度值与β-半乳糖苷酶活力呈显著负相关（P＜0.05）。综合分析可见，由保加利亚乳杆菌发酵的酸乳在冷藏过程中的酸度值与β-半乳糖苷酶活力的相关性大，由嗜热链球菌发酵的酸乳在冷藏过程中的酸度值与蛋白酶活力的相关性大。

3 结论与讨论

（1）酸奶的风味很大程度上取决于酸度，因此研究酸奶中乳酸菌在冷藏过程中的产酸能力对酸奶发酵剂菌种的选择具有重要意义。适度的蛋白水解可改善制品风味和品质，特别是乳酸菌蛋白水解和菌体破裂释放的酶对酸奶成熟发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性高低，对外表现为能不能有效地利用乳糖，它可以将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，之后单糖被分解代谢，在乳糖代谢中起着重要作用。

（2）乳酸菌经发酵产生乳酸、柠檬酸等，其中乳酸是乳酸菌将乳中的乳糖分解而得到的，是酸乳酸度的主要来源。而乳糖经β-半乳糖苷酶分解所产生的乳酸，反过来又抑制β-半乳糖苷酶的活性，使其活性下降，并且乳酸对不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中的β-半乳糖苷酶活力抑制程度不同，这使不同乳酸菌发酵的酸奶在冷藏过程中的β-半乳糖苷酶活性大小不同，并且下降幅度存在差异。但在冷藏到15d时，β-半乳糖苷酶活力还有进一步下降的可能，此时的乳酸度还不足以抑制β-半乳糖苷酶的活性。由上述分析可知，β-半乳糖苷酶可作为酸奶冷藏过程中的关键酶。

（3）S.t02的蛋白酶活力从一开始就居高不下，变化却不呈一定规律性，这一点可以反映出S.t02具有较高的蛋白酶活力，开始的变化幅度比较小，可能原因是乳酸菌的生长摄取了自身酶分解蛋白质释放的游离氨基酸。

4 参考文献

[1] 贾英民.食品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2001.

[2] DRIESSEN F M，PUHAN Z.发酵乳科学与技术[M]. 顾瑞霞，译.南京：东南大学出版社，1991.

[3] 李庆钟.微生物菌种保藏技术[M].北京：中国轻工业出版社，1998.

[4] GRAPPIN R，BEUVIER E.Posible implicatiom of milk pasteurization on the manufacture and sensory quality of ripened cheese[J].International Dairy Journal，1997（12）：751-761.

[5] 黄伟坤.食品检验与分析[M].北京：中国轻工业出版社，1998.

[6] N A GREENBERG.Production and Characterization of β-galactosidase from Streptococcus thermophilus[J].Food Sci，1982（47）：1824-1835.

[7] 陈铁涛.克鲁维酵母培养特性及透性化细胞乳糖酶的研制与应用[D].哈尔滨：东北农业大学，1998.

[8] FRANK C，CHURCH.Spectrophotometric Assay Using O-phthaldial dehyde for Determination of Proteolysis in milk Isolated milk proteins[J].Dairy Sci.，1983（66）：1219-1227.