８种大白菜过氧化物酶同工酶分析

2009-05-25孙海燕王利沙

现代农业科技 2009年5期

孙海燕　王利沙

摘要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对8个大白菜品种的过氧化物酶（POD）同工酶进行分析。结果表明，8个品种的POD同工酶酶谱在酶带数、迁移率、酶量（酶带宽窄）及酶活性（酶带深浅）等方面均存在相似性，但也有一定的差异。依酶谱带特征初步将8个品种进行分类，并对其亲缘关系进行了分析。

关键词大白菜；过氧化物酶同工酶；谱带；亲缘关系

中图分类号 S634.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）05-0008-02

同工酶广泛存在于生物界中，它表现出明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志[1]。过氧化物酶同工酶在高等植物中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性，即同一器官的同一发育时期，POD同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映植物的遗传特性[2]。因而同工酶分析技术被广泛地运用于植物的分类鉴定、亲缘关系及矮化砧木的预选、抗寒性和抗病性鉴定等研究领域。笔者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对潍坊地区普遍栽种的8个品种的大白菜过氧化物酶同工酶进行分析研究，以期在测定同工酶谱带的基础上，探讨以同工酶谱带特征作为大白菜品种鉴定的依据，进一步测定大白菜品种间的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料购于潍坊市农科院蔬菜研究所，共8个品种，分别为：潍白秋冠、潍白-78、潍白-68、潍白ER-60、潍白-45、潍白四号、潍白二号及潍白一号。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液提取。取8个品种大白菜的种子放入培养皿中，加水在培养箱中（15～25℃）黑暗条件下培养4d。分别取叶片（除去叶脉）0.5g，洗净用滤纸吸干水分，剪碎置于预冷的研钵中，加入酶提取液（由蔗糖10mL、电极缓冲液2mL、无离子水8mL组成）1mL，研磨成匀浆，移入离心管中，8 000rpm离心10min，取上清液备用。

1.2.2 电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳参照张卫国（2006）等的方法[2-6]，略有改进。染色参照杨太兴（1991）、孟秋峰（2006）方法[7，8]，采用醋酸—联苯胺法，略有改进。染色液的成分为：联苯胺0.5g，冰醋酸3.75mL，4%氯化铵溶液1g，30%双氧水350μL，5%EDTA 25mL，加蒸馏水混合定容至100mL。

1.2.3 照相及绘制酶谱模式图。电泳照片拍照，并根据各酶带的相对迁移率绘制过氧化物酶同工酶酶谱模式图。酶带的相对迁移率Rf = 酶带的迁移距离/溴酚蓝的迁移距离[9]。

2 结果与分析

2.1 不同品种大白菜过氧化物酶同工酶酶谱特征

大白菜叶片过氧化物同工酶经电泳后，显示的酶谱带3~5条不等（见图1），从酶谱表型可以看出，同类品种的酶谱具有较稳定的相似性。把它们分成A、B、C等3个区，其中A区有1~2条酶带，染色较深；B区染色浅，酶带数1~2条不等；C区染色最深，活性最高，有1条酶带。酶带的染色深浅在一定程度上表示了酶活性的强弱不同。潍白ER-60酶带的活性普遍低于其他品种。

2.2 迁移距离

溴酚蓝（即前沿指示剂）的迁移距离为7.1cm；8个大白菜品种的过氧化物酶同工酶谱带的迁移距离见表1。各个品种的酶带数差别较大，但部分酶带的排列具有一定的规律性。另外，从表1可以看出，在大白菜谱带的B区有一条特征性谱带，迁移距离是4.45cm。

2.3 过氧化物酶同工酶的相对迁移率

8种大白菜共产生32条酶带，表现出13种不同的迁移率，Rf值变动在 0.17~0.88之间，但酶带出现的频率差异不是很大。酶带的迁移距离与酶带数见表2所示。综合8个品种的酶带迁移率可以得出，Rf =0.63位置的酶带可以说是几个白菜品种的基本谱带，为8个品种所共有。酶谱模式见图2。

2.4 过氧化物酶同工酶酶谱间相似系数

相似系数采用以下公式计算：C＝2W/（a+b）[5，9]；其中：C为酶谱间相似系数；W为A和B 2个品种相同的酶带数；a为品种A在酶谱中的酶带数；b为品种B在酶谱中的酶带数。不同品种大白菜的酶谱间的相似系数见表3。

从表3中可以分析出，相似系数越大，说明品种间的亲源关系越近。相反，相似系数越小，品种间的亲源关系就越远。相似系数最大的是潍白一号与潍白二号、潍白四号与潍白-45、潍白二号与潍白-68，相似系数都为0.75；其次为潍白秋冠与潍白-78，相似系数为0.66；潍白ER-60与潍白-45、潍白ER-60与潍白四号相似系数都为0.57；潍白-68与潍白-78、潍白二号与潍白-78、潍白一号与潍白-78、潍白-68与潍白一号、潍白-45与潍白一号、潍白-45与潍白二号相似系数都为0.50；其余品种之间的相似系数较小。

3 结论与讨论

过氧化物酶同工酶分析法不仅能较为客观地反映物种间的遗传差异和它们的亲缘关系，而且利用其进行物种的辅助鉴定，是一种较为方便、有效的手段[10]。过氧化物酶同工酶在大白菜中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性。即同一器官的同一发育时期，POD同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映大白菜的遗传特性[11，12]。要想研究过氧化物酶与不同品种的系谱进化及抗逆性之间的关系，应选具有代表性、一致性的品种，最好是地方品种。因为品种在迁移过程中可能会出现变异或环境的不适应，同时过氧化物酶受气候环境、温度、生长发育时期等方面的影响也很大[13]。作为基因的表达产物，酶具有一定的不稳定性，在很多情况下要受到环境条件的影响，而且许多因素也会影响电泳及分析效果，这都使得试验存在一定的误差。

本试验的8个大白菜品种是潍坊地区普遍栽植的品种，经分析在酶带数量、位点及分布格局上有一定的相似性，在酶带的共性方面也表现出一定的相似性，即品种与品种之间、几个品种之间出现相同的1~3条同带。这说明他们在种间有一定的相似性，8种植物间存在着亲缘关系。这种亲缘关系还需要通过进行种间相似性聚类分析进一步得出结论。

4 参考文献

[1] 闫忠业，伊凯，李作轩，等.富士系苹果过氧化物酶同工酶研究[J].沈阳农业大学学报，2006（4）：578-581.

[2] 刘永军，王同坤，齐永顺，等.不同板栗品种（系）过氧化物酶同工酶的分析比较（简报）[J].河北科技师范学院学报，2006（4）：72-75，80.

[3] 陈学群，周光凡，周源，等.芥菜脂酶同工酶分析[J].西南农业学报，1993，6（3）：40-46.

[4] 刘永军，郭守华，杨晓玲.植物生理生化实验[M].北京：中国农业科技出版社，2002.

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[8] 杨太兴，贾希海，李仁风，等.同工酶电泳技术在品种纯度检验中的应用研究[J].种子，1991（6）：1-5.

[9] 陈学群，周光凡.芥菜脂酶同工酶分析[J].西南农业学报，1993，6（3）：40-46.

[10] 谢可军，李阳春，吴天德.10种早熟禾属植物的过氧化酶同工酶分析[J].中国草地，2003，25（2）：30-33.

[11] 吴少伯.植物组织中蛋白质及同工酶的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳[J].植物生理学通讯，1979（1）：30-33.