ｐＴＡＴ－ＨＡ质粒载体在受体菌ＤＨ５α中的转化及鉴定

蒋常文　夏春波　徐雅娟　周　思　刘源劼　刘　静

【摘要】 目的 探索pTAT-HA质粒在受体菌DH5α中转化的方法。方法 配制LB培养基，将pTAT-HA质粒转化至DH5α，培养筛选成功转化子，电泳鉴定。结果 pTAT-HA质粒转化菌可在Amp+LB培养基中生长，电泳结果显示质粒大小准确无误（约3000 bp）。结论 pTAT-HA质粒转化成功，转化菌可冷冻保存质粒，提取的质粒可用于下游分子生物学实验。

【关键词】 pTAT-HA质粒；DH5α；转化

【Abstract】 Objective To explore the method thatDH5α was transformed with pTAT-HA vector.Methods LB medium was prepared,pTAT-XIAP vector was transformed into E.coli.DH5α.competent cells.Results Transformants were cultured on LB medium and selected.The plasmids were extracted,purified andidentified by agarose gel electrophoresis.Transformed DH5α Could grow on LB medium containing ampicillin,gel electrophoresis analysis showed that the molecular weight of pTAT-XIAP vector was about 3000 bp consistent withthe vector.Conclusion The pTAT-XIAP vector was succesfully transformed into the DH5α and the transformants were stored by cryopreservation,the purified plasmid could be used for molecular biologic experiments in the future.

【Key words】 pTAT-XIAP plasmid;DH5α;Bactria

转化是在基因工程中向受体细胞导入外源基因的主要手段，在分子生物学研究中具有重要的作用，探索高效、快速转化受体菌的方法是目的基因保存、扩增和进行后续研究的基础。本实验将pTAT-HA质粒载体转化至DH5α受体菌，取得了成功，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 pTAT-HA质粒（美国Steven F Dowdy惠赠），DH5α感受态细胞（购自TIANGEN公司），Biospin质粒DNA小量提取试剂盒（BIOER公司，Cat＃ BSC01M1），无水乙醇，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂粉，氨苄青霉素。

1.2 方法

1.2.1 LB培养基的配制 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，溶解并定容至1000 ml，调pH至7.4，固体培养基加2%琼脂粉，高压灭菌。选择培养基加氨苄青霉素至终浓度50 μg/ml。

1.2.2 pTAT-HA质粒转化与筛选 取100 ml DH5α感受态细胞于冰水浴，向感受态细胞中加入10 μl pTAT-HA质粒DNA，冰浴静置30 min，将离心管置于42℃水浴90 s，冰浴冷却2~3 min，向离心管中加入900 μl LB液体培养基（不含抗生素），37℃摇床震荡培养45 min。取100 μl转化菌液加到LB固体培养基（含氨苄青霉素），37℃培养12~16 h，照相。

1.2.3 pTAT-HA质粒扩增及鉴定 取单个转化菌落接种至LB液体培养基培养过夜，将1~1.5 ml菌液加入1.5 ml无菌EP管中，10 000转/min离心30 s，弃上清，加250 μl Resuspension Buffer重悬菌体，加250 μl Lysis Buffer，轻柔颠倒4~6次，加350 μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒4~6次，12 000转/min离心15 min。将上清液转移到Spin column内，6 000转/min离心1 min，弃接液管液体，加650 μl Wash Buffer，12 000转/min离心30~60 s，弃接液管液体，再次于12 000转/min离心1 min，将Spin column转移至1.5 ml无菌EP管中。向Spin column内加TE溶液50 μl，静置1 min，于12 000转/min离心1 min。取5 μl离心管内液体于150 V电压，1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪观察，凝胶成像系统照相。

2 结果

2.1 DH5α在LB固体培养基中的生长情况 培养结果显示，转化菌液在含氨苄青霉素的LB固体培养基上呈分散菌落生长，在无氨苄青霉素的LB固体培养基上成片生长，DH5α感受态细胞（无pTAT-HA质粒）在含氨苄青霉素的LB固体培养基上未见菌落生长，图1。

2.2 pTAT-HA质粒电泳结果 电泳结果显示，pTAT-HA质粒条带大小与试剂说明书中的一致，无基因组条带；未转化的DH5α感受态细胞中无质粒DNA条带，图2。

3 讨论

大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理后得到DH5α感受态细胞，菌细胞在低温和低渗溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，此时转化液中的DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经短暂的热休克后容易进入菌体细胞中［1］。热休克温度是决定转化成败及转化效率高低的关键因素，温度过低转化效果不理想，过高使大肠杆菌细胞壁的通透性过强，易导致质粒的丢失，所以应选择42℃作为最佳热休克温度［2］。有报道［3］，转化时间对转化率的影响显著，在15~60 min之间，随着转化时间的延长，转化率提高，而超过 60 min，转化率则无进一步的提高。本实验采用冰浴30 min，42℃热休克作用90 s，冰浴冷却2~3 min，37℃温孵45 min可获得较高的转化效果。pTAT-HA质粒中有抗氨苄青霉素基因，故含pTAT-HA质粒的DH5α（转化子）能在Amp+LB培养基中生长，其余不能存活。而未经转化的DH5α在Amp+LB培养基中不能生长，说明在Amp+LB培养基中生长的DH5α是由外源基因（即pTAT-HA质粒）转化成功发挥了作用。

在提取pTAT-HA质粒进行鉴定时，需注意提取的菌细胞不宜过多，否则会影响质粒的质量。加入菌体裂解液后不宜剧烈振动、作用时间不宜过长（5 min），以防止基因组DNA被剪切，出现非特异性条带，影响鉴定。本实验成功将pTAT-HA质粒转化至DH5α感受态细胞，电泳鉴定明确的pTAT-HA质粒可用于下游分子生物学实验或-20℃保存。

参 考 文 献

［1］ 张果，昌晓红，石菁菁，等.卵巢癌抗独特型单链抗体6B11 scFv与鼠HSP70融合蛋白的构建、表达及鉴定.中国医药生物技术，2008，3（5）：336-342.

［2］ 金文辉，郭焱，崔健丽，等.人卵GST-ZP3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性的检测.中国妇幼保健，2008，23（23）：3311-3314.

［3］ 郭英，曲章义.流感病毒RNA聚合酶PA亚基重组质粒pQE32-PA-2转化效率的实验研究.齐齐哈尔医学院学报，2003，24（2）：221.