植物种质资源离体保存技术研究进展

钟兰 刘玉平 彭静

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉，430065）

植物种质资源离体保存技术研究进展

钟兰 刘玉平 彭静

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉，430065）

植物种质资源的保存对于生物多样性保护和新品种选育均具有十分重要的意义。综述了国内外植物种质资源离体保存技术最新研究进展，并提出了有待继续研究的相关问题。

植物种质资源 保存 组织培养 超低温保存

种质资源又称遗传资源。种质系指农作物亲代传递给子代的遗传物质，它往往存在于特定品种之中。如古老的地方品种、新培育的推广品种、重要的遗传材料以及野生近缘植物，都属于种质资源的范围。种质资源是物种进化、遗传学研究及植物育种的物质基础，是保障人类良好生存环境和衣食住行必不可少的财富，是关系到一个国家和民族竞争力的重要战略物质。但随着人口的发展，土地的开发，自然环境的恶化，品种资源的流失日益严重，再加上现代农业的发展，品种单一化在世界范围内愈演愈烈。因此，植物种质资源保存已成为全球关注的热点课题。

20世纪60年代以来，世界各国（特别是经济发达国家）对植物种质资源的收集和保存工作都加大了投入和研究力度，许多国家已建立了比较完善的田间基因库。但是，田间活体保存占地广，需要耗费大量的人力、物力和财力，易受自然灾害影响。因此，许多科技工作者在寻求更经济、实用、安全的保存方法。

20世纪50～60年代，植物组织培养技术开始出现，之后得到不断完善和发展。1975年，Henshaw和Morel等首次提出离体保存植物种质资源的策略[1]。离体保存以其无菌培养、占用空间小、劳动力和维持开支少，易于国际间交流等特点克服了田间保存的缺点，从而得到了世界各国的重视[1]。有关国际组织和许多国家相继建立了植物种质离体基因库[3]。运用组织培养技术保存种质已取得了很好的效果，但是也产生了新的问题如频繁继代，容易导致体细胞无性系变异，从而使保存的原始种质丢失。经过许多科学家的努力，通过修正组织培养条件，主要是通过调整培养基配方、降低培养温度来减缓保存材料的生长；超低温技术的运用甚至能完全抑制保存材料的生长，从而延长继代周期，控制变异的产生，使变异降低到可以接受的最低程度，并已取得重大进展。按照保存的技术手段，植物种质资源的离体保存方法可以分为一般保存、缓慢生长法保存和超低温保存等。本文就种质资源离体保存技术方面的研究进展作一评述。

1 一般保存

一般保存是在常规培养条件下对培养物通过不断继代的方式进行保存的方法。目前，多数植物资源的离体保存仍采用这种方式。采用该方法保存的材料可以随时进行扩繁，因此利用起来很方便，但由于需要不断继代培养，易造成材料的污染、混淆，甚至丢失，并且常会导致遗传变异的发生。

2 缓慢生长法保存

缓慢生长法是通过调节培养条件，抑制保存材料的生长和减少营养消耗来延长继代时间、减少操作和劳力的保存方法。减缓保存材料生长的具体途径如下。

2.1 降低培养环境的氧气含量

常用的方法是在材料上覆盖一层矿物油和液体培养基。Caplin离体保存胡萝卜根的次生韧皮部时，在保存材料上覆盖一层重石油，最厚达38 mm，8个月后覆有矿物油的材料生长很少，而且仍是鲜艳的绿色，培养基未见减少，而未覆矿物油的材料变褐，培养基已渐干涸。但Engelmann[3]认为，这种方法易使外植体发生玻璃化现象，材料恢复正常培养条件后再生慢，易坏死。减少材料周围的氧气含量的另一条途径是降低培养室的大气压或改变气相成分。

2.2 营养控制

采用降低培养基中的营养也可以减少材料的生长，以达到延长保存时间的目的。菠萝试管苗在无菌水和1/4 MS培养基中保存1 a，存活率分别达81%和100%，且比保存在完全MS培养基中的试管苗活力强。美国Hilo国家无性系资源圃已采用该技术进行菠萝种质保存。赵密珍等发现，1/4 MS+ 0.5 mg/L BA+15 g/L蔗糖+12.5 g/L琼脂是常温保存草莓试管苗的最适培养基，在该培养基中草莓试管苗可保存11～13个月。铁皮石斛试管苗在MS，1/2 MS和1/4 MS培养基上保存1 a后，MS培养基保存效果最差，存活率只有41.67%，而1/4 MS和1/2 MS培养基上的存活率分别为91.67%和100%。咖啡分生组织培养的小植株在无蔗糖的1/2 MS培养基上，可保存2.0～2.5 a。

2.3 培养基中添加生长调节剂

最常用的生长抑制剂有脱落酸（ABA）、丁酰井（B9）、多效唑（PP333）和矮壮素（CCC）等。在进行猕猴桃离体保存时，培养基中添加0.5 mg/L多效唑能够有效抑制试管苗的生长，11个月后存活率为90%。张利平等对36个品种葡萄种质进行了常温长期保存。发现多效唑适用于供试的36个品种，且多数基因型的葡萄试管苗已保存2 a，以2.0 mg/kg的浓度为好。研究表明，ABA对草莓试管苗芽增殖的抑制作用随ABA使用浓度的增加而明显增强，且均存在显著性差异，从常温保存试管苗的存活率看，以3.0 mg/LABA处理对草莓试管苗保存效果最为理想，保存到12个月时，试管苗的存活率最高，为62.5%，较不使用ABA处理的保存时间延长5个月以上。在红根草试管苗的保存中,CCC浓度为1.2 mg/L和1.6 mg/L时，保存360 d时存活率仍达90%。王桂兰等研究指出，200 mg/L B9处理的苹果转接苗均因抑制过度而死亡；100 mg/L B9抑制作用明显，保存4个月后苹果试管苗节间极小、叶小色深呈莲座状，说明B9的生长延缓作用较为剧烈，所以不适宜苹果试管苗的保存。

2.4 降低培养温度

采用控制温度来降低或完全抑制保存材料生长是中期保存最常用的方法。不同植物种类要求的最佳保存温度不尽相同，甚至相差很大。一般耐寒物种在0～5℃下进行保存，而一些亚热带物种一般要保存在10℃左右，一些热带物种则必须保存在15℃以上。Oka等在5℃下保存 “Senryo”梨（）和西洋梨品种“Winter Nelis”茎尖分生组织，64周后存活率及再生率几乎为100%，而0℃下保存4周后即死亡。Reed在4℃下，用聚乙烯塑料袋保存96个较抗寒的草莓品种植株，12个月后，存活率达76%。蛇根木（）是一种濒危的珍贵药用植物，在25℃下离体保存节部组织，继代周期为9个月，在15℃下为15个月，温度如降为10℃和5℃，保存材料则坏死，2个月后都死亡。

2.5 提高培养基渗透压

通常在培养基中加入甘露醇、蔗糖或者山梨醇等来提高培养基的渗透压，从而抑制材料的生长。这类化合物是惰性物质，不易被外植体吸收，而且抑制外植体生长的作用持久。在MS培养基添加1%～3%甘露醇，淡黄花百合组培苗保存10个月后，存活率为92%左右，存活的组培苗接种于增殖培养基上，100%正常生长和增殖。绿秆芋茎尖可在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA+2 mg/L ABA+20 g/L甘露醇的培养基上，于15℃，100 lx光照的条件下保存350 d，单芽存活率达90%以上，且具良好的生长与恢复分化的能力。以芽的叶柄为外植体，在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA培养基中培养，一代繁殖系数可达5.5以上[4]。

除保存技术外，影响种质资源中期保存效果的因素还有外植体类型和生理状态、保存容器的类型、容积和封口方法等。如适于进行中期保存的外植体类型有愈伤组织、离体小苗、茎尖、茎段、丛芽等，同种植物的外植体类型不同，保存效果也不同[5]，选择合适的外植体类型进行保存是最重要的。

3 超低温保存

超低温保存是指在-80℃以下的超低温中保存种质资源的一整套生物学技术。超低温常用的冷源有干冰（-79℃）、深冷冰箱、液氮（-196℃）及液氮蒸汽相（-140℃）。在超低温条件下保存材料，可以大大减慢甚至终止代谢和衰老过程，保持生物材料的稳定性，最大限度地抑制生理代谢强度，减少遗传变异的发生。超低温保存可以克服常温及低温保存过程中，由于继代而产生的遗传不稳定性，并且还可以减少工作量，减少污染机会等。迄今，不同的植物材料如愈伤组织、胚轴、茎尖、花粉、根尖、休眠芽、原生质体等的超低温保存都有报道。愈伤组织的超低温保存相对容易，方法简单，但由于其再生能力和遗传的不稳定性，不是理想的种质保存材料。茎尖分生组织由于细胞分化程度小，在植物保存后的再生过程中，比其他细胞培养物的遗传性稳定，是超低温保存的一种理想材料。植物细胞内含有大量的水分，低温冰冻过程会使水结冰，造成细胞结构不可逆转的破坏，导致死亡。因此，超低温保存成功与否，关键是怎么避免细胞内结冰，使细胞达到玻璃化。现在常用的芽及茎尖分生组织超低温保存的方法大致有5种。

3.1 慢冻法

通常是以0.5～1.0℃/min的降温速度，从0℃降到-30～-40℃，随后浸入液氮，或者以缓慢的速度连续降到-196℃。在有些情况下，在-30～-40℃预冻一段时间，然后才浸入液氮，此方法称之为两步冰冻法或分步冰冻法。Brison等采用两步冰冻方式，保存两个桃砧木品种离体生长的茎尖，再生率分别为69%和74%。这种方法需要程序降温器，步骤较为繁杂。

3.2 快冻法

以超过40℃/min的速度降温，或将材料直接放入液氮或其蒸汽相中。该方法较简单，不需要复杂昂贵的设备，可使细胞内的水还未来得及形成冰晶，就降到-196℃的安全温度。到20世纪90年代，传统的快冻法已被玻璃化法取代。

3.3 玻璃化法

在冰冻前，使用高浓度的冰冻保护剂，即玻璃化液，在25℃或0℃处理一段时间，诱导脱水，然后直接浸入液氮中，此时，冰冻保护剂溶液和保存材料一同进入玻璃化状态。此方法简单易行，省时省力，但对植物的毒害较大，较难在同一时间内处理大量的材料。Kobayashi等将脐橙珠心细胞经过一个玻璃化过程后，放入液氮中保存1 a，平均存活率超过90%，通过DNA及形态学检测显示遗传物质及再生的植株形态与保存前都没有变化。Sakai等[6]将脐橙、葡萄柚等6种植物的珠心细胞通过玻璃化方式，在液氮中保存4个月，存活率也达90%。玻璃化保存的最大难题在于玻璃化冰冻保护剂的化合物组成及配制浓度。

3.4 包埋/脱水法

用藻酸盐包埋茎尖，在含高浓度蔗糖的培养基中预培养后，在通风橱中处理2～6 h或用硅胶处理，通过空气蒸发脱水，然后进行超低温保存。此方法一次能处理较多材料，避免了使用一些对细胞有毒性的冰冻保护剂，但在一些植物中，成苗率低，与玻璃化法相比，组织恢复生长较慢，脱水所需时间长。Niino等[7]利用包埋/脱水方式在液氮中保存苹果、梨及桑树离体生长的茎尖5个月，存活率达80%以上；将这3种材料胶囊化，再经过一个脱水过程（含水量在40%左右），放入-135℃下保存5个月，几乎都能再生成芽。

3.5 包埋/玻璃化法

Phunchindawan等[8]将辣根芽原基胶囊化后，在0.5 mol/L蔗糖的MS培养基中培养1 d，再用高浓度的玻璃化溶液PVS2脱水4 h，直接放入液氮中保存3 d，69%存活。Matsumoto等将玻璃化与胶囊化方法结合起来，在液氮中保存山葵（茎尖分生组织，也取得了60%以上的存活率。

为了得到较高的超低温保存成活率，现在的研究多重视对预培养条件的研究。其出发点是为了改变材料的生理状态，增加细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增加保护性物质，使其能够经受起超低温保存过程中的高度脱水和剧烈的温度变化等逆境，从而获得较高的保存成活率。常用的措施有①加入渗透保护物质。在预培养培养基中加入蔗糖[9]、聚乙二醇和二甲基亚砜可以提高成活率。②添加化学成分。预培养时，在培养基中添加ABA，水杨酸等化学成分来诱导材料对低温的抗性，可以提高保存存活率。③低温锻炼。用低温锻炼的方法来提高材料的抗冻性，从而提高超低温保存效率。

综上所述，植物材料的超低温保存，要根据材料本身的特性，对影响超低温保存的因素进行研究，寻找提高超低温保存成活率和再生率的合理途径，达到成功保存的目的。

4 展望

离体保存技术由于其具有省时、省地、省空间和无病虫害侵染等优点，被广泛应用。我国水生蔬菜资源十分丰富，生态类型也多种多样，为保存这些特有的水生蔬菜资源，除了进行田间保存，开展离体保存显得意义重大。目前，国家种质武汉水生蔬菜资源圃已对部分水生蔬菜资源如莲藕、芋、慈姑、荸荠等的离体保存做了相关研究，虽已取得一定进展，但许多问题尚需进一步探讨，如存活率较低，在长期（10 a，20 a，甚至更长时间）保存后，材料的生活力和存活率如何？能否再生植株？另外，离体保存技术在植物育种和生物多样性保护上的巨大潜力还有待于进一步研究开发。离体保存技术的进一步改进以及保存后植株遗传稳定性的研究都将是今后植物离体保存的研究重点。相信随着研究工作的不断拓展和深入以及技术设施的不断改进，离体保存技术将日臻成熟，有望在不久的将来得到更广泛的利用。

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[6]Sakai A,Kobayashi S,Oiyama I.Cryopreservation of nucellar cells of navel orangeOsb.var. brasiliensis Tanaka)by vitrification[J].Plant Cell Reports, 1990,9:30-33.

[7]Niino T,Rashiro K,Suzuki M,et al.Cryopresevation of in vitro grown shoot tips of cherry and sweet cherry by onestep vitrification[J].Sci Hort,1997,70:155-163.

[8]Phunchindawan M,Hirata K,Sakai A,et al.Cryopreservation of encapsulated shoot primordia induced in horseradishhairy root cultures[J]. Plant Cell Rep,1997,16:469-473.

[9]Panis B,Totte N,Van Nimmen K.Cryopreservation of bananaspp.)meristem cultures after preculture on sucrose[J].Plant Sci,1996,121:95-106.

Progress in Techniques for in vitro Preservation of Plant Germplasm Resources

ZHONG Lan,LIU Yuping,PENG Jing

The conservation of plant germplasm resources has extremely vital significance for the biology biodiversity conservation and plant breeding of the new cultivar.The latest advances of techniques for in vitro preservation of plant germplasm resources were summarized.The problems and the perspective of this field were also discussed.

Plant germplasm resource;Preservation;Tissue culture;Cryopreservation

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.002

钟兰，女，博士，现从事水生蔬菜花卉研究与推广，电话：027-88116313。E-mail：zhonglanlan_818@sina.com

2009-07-22