芸薹属作物游离小孢子培养研究进展

刘乐承，付明星，林小芳

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州，434025)

芸薹属作物游离小孢子培养研究进展

刘乐承，付明星，林小芳

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州，434025)

综述了芸薹属(Brassica)作物游离小孢子培养的研究进展，主要涉及到影响培养的主要因素和培养技术在育种中的应用2个方面。

芸薹属(Brassica)；游离小孢子培养；育种

芸薹属(Brassica)是十字花科植物300多个属中最重要的一个属，主要包括白菜类、甘蓝类和芥菜类3大类蔬菜，种质资源非常丰富，是我国栽培面积最大的蔬菜作物[1]。近年来，随着我国蔬菜产业的发展，芸薹属作物育种面临许多新的问题和挑战。小孢子是高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段。游离小孢子培养(Isolated microspore culture)是指不经任何形式的花药预培养，直接从花蕾或花药中获取游离状态的新鲜小孢子群体进行培养的方法。芸薹属作物游离小孢子培养始于1982年，Lichter[2]首次对甘蓝型油菜(B.napus)游离小孢子培养并形成植株做了报道。此后，游离小孢子培养技术先后在芸薹属作物中的结球甘蓝、大白菜、花椰菜、小白菜、黑芥、叶芥、青花菜等十余种蔬菜中取得了一定进展[3～5]。该技术具有基因型纯合速度快、分离较简单、基因型固定、可作为外源基因的良好受体等优点。因此，游离小孢子培养研究对芸薹属作物的基础研究与应用研究均具有十分重要的意义。

1 游离小孢子培养的影响因素研究

1.1 外植体对小孢子胚状体发生的影响

(1)基因型的影响 Vyvadilova等[6]对几种甘蓝类蔬菜的研究发现，基因型和小孢子发育阶段是影响小孢子出胚率的主要因素。刘凡等[7]则发现结球白菜比不结球白菜、结球白菜中的叠抱类型比合抱类型、早熟类型比晚熟类型具有更强的胚胎发生能力。严准等[8]在同样条件下对4种甘蓝材料进行游离小孢子培养，只有苤蓝有胚状体产生，青花菜仅诱导出了大量愈伤组织，青苤蓝和结球甘蓝既无胚状体又无愈伤组织产生。王涛涛[1]也只在73.3%的大白菜、76.9%的紫菜薹和50%的甘蓝中分别获得了小孢子胚状体。而桑玉芳[9]的研究结果表明19个甘蓝基因型小孢子培养的诱导率差异显著，其中3个无法获得胚状体。因此，胚状体的诱导与供体材料的基因型密切相关。此外，供体材料的不同基因型之间产胚率也存在较大差异，如曹鸣庆等[10]研究发现，产胚率最高的大白菜的平均产胚率可达350个/蕾，而大多数基因型的大白菜平均产胚率在2个/蕾以下。

(2)植株生理状态的影响 Duijs等[11]对供体植株的生长环境对小胞子培养的影响进行了研究，认为高大健壮的植株出胚率较高、出胚比较稳定。另外，小孢子培养还受供体植株生长环境，如温度、光照等的影响。方淑桂等[12]认为大白菜供体植株生长在10～25 ℃气温条件下较适宜，最高气温超过28 ℃时小孢子胚状体诱导率大大降低。官春云[13]在油菜小孢子培养中发现，来自生长室的供体植株，小孢子成胚的百分率高。

为了获得活力较高的小抱子，供体植株的栽培季节也很重要。曹鸣庆等[10]认为大白菜的开花季节为4～5月，此时温度一般较高，为了提高小孢子胚胎发生率应把供体植株花期安排在冬季和早春。花椰菜的花药培养也是冬、春季效果好于夏、秋季[14]。为供体植株创造适宜的生长条件，使其不受逆境影响，是提高小孢子培养出胚率的重要保证。

(3)小孢子发育阶段的影响 小孢子发育阶段分为单核期、双核期和三核期，单核期又可分为单核早期、单核中期和单核靠边期。胚胎发生的激发启动大致发生在单核中期至单核靠边这一短暂的发育过程中。小孢子发育时期与花蕾形态指标，如花蕾长度、花药长度、花瓣长/花药长等密切相关。曹鸣庆等[10]发现，CC11基因型大白菜花蕾长2.0～2.5 mm时，小孢子处于单核中期至单核靠边期，小孢子胚产量最高。李岩等[15]也报道小白菜单核中期至单核靠边期的小孢子易于诱导胚胎发生。张德双等[16]、桑玉芳[9]分别发现绿花菜、甘蓝的小孢子胚诱导率以单核靠边期到双核早期阶段最高。王涛涛[1]发现在添加一定量的活性炭时和设定一定花粉密度时，选择单核靠边期比率为50～70%的小孢子，有利于大白菜和紫菜薹的小孢子发生，而在选择含10～30%的双核期小孢子有利于甘蓝的小孢子发生。因此，在培养中要根据不同品种依据不同的形态指标来获取最适宜诱导的小孢子群体。

1.2 培养方法和条件的影响

(1)花粉预处理的影响 对试验材料进行预处理，通过外界的胁迫作用使小孢子发生一系列的生理生化变化，促使小孢子完成脱分化启动，从而改变小孢子的发育途径，提高培养效率。预处理操作包括离心、低温、高温、射线、甘露醇预处理和预培养等方式，目的在于改变细胞的生理状态、分裂方式和发育途径。自从Keller和Armstrong[17]在甘蓝型油菜花粉培养中，首次用高温处理提高花粉胚的诱导频率获得成功以后，该方法被广泛用于芸薹属植物的游离小孢子培养[1]。甘蓝小孢子在30～35 ℃下预处理24～48 h，可以明显提高胚状体诱导效率。周伟军等[18]对油菜游离小孢子分别进行32 ℃和30 ℃热激暗培养3 d和7 d，胚胎发生好、产胚率高。但是，桑玉芳[9]在甘蓝小孢子培养前对花蕾进行0～4 ℃ 48 h的低温预处理，在培养初期给予小孢子33 ℃ 24 h的高温暗培养，可以获得较好的诱导效果。张小玲等[19]以强度300 mT的均匀磁场处理花椰菜花药30 min，取得了较好效果。在游离小孢子培养中前期的预处理是非常必要的，它不仅提高了小孢子胚产率，也会影响小孢子再生植株的二倍体株率。

(2) 培养基及附加物质的影响 培养基是诱导胚胎发生的基础，用于小孢子培养的培养基成分因植物材料的不同而差异较大，但其组成应尽可能确保维持小抱子活力，提供小孢子胚胎发生所必需的有机、无机成分，以达到高的胚诱导频率。一般在小孢子胚状体的诱导培养中，所采用的基本培养基为NLN培养基。与MS、B5等培养基相比，NLN的主要特点是大量元素含量较低。余凤群和刘后利[20]比较发现甘蓝型油菜小孢子在MS、B5培养基上未发现胚状体，在1/2 MS、1/2 B5培养基上形成少量胚状体，在NLN上形成大量胚状体。

培养基的外源激素是小孢子培养中必不可少的成分，但关于外源激素对小孢子胚胎发生和植株再生的影响还未取得一致的认识。如2001年许艳辉等[21]报道，0.2 mg/L的6-BA对大白菜小孢子胚胎发生有一定的促进作用，而桑玉芳[9]发现激素在甘蓝小孢子培养中具有重要的影响，但是不同的基因型对激素的反应不同。

大量试验研究表明培养基中添加适量活性炭(AC,Activated charcoal)能明显促进小孢子的胚胎发生。杨清等[22]在冬花椰菜小孢子培养时，培养基中加入0.5 g/L的AC能提高发生率。Halkjaer等[23]认为pH在6.0附加AC可促进胚产量。王涛涛[1]发现在添加一定量的AC时有利于大白菜、紫菜薹和甘蓝的小孢子发生。桑玉芳[9]也发现在培养基中添加AC，甘蓝基因型胚产量所占比例在总体上有大幅度的提高。在培养初期，培养基中添加秋水仙素可以促进细胞分裂，有助于小孢子发育成胚， 如顾宏辉等[24]用0.8 mg/L秋水仙碱直接处理分离小孢子液也能明显增加胚状体产量。

(3)花粉密度的影响 不同密度的小孢子对培养基中营养的竞争，以及自身在发育过程中不同物质的代谢都对小孢子的发育有很大的影响。李岩等[15]发现大白菜小孢子培养时采用1×105个/mL的密度比较适宜；Dias等[25]研究表明甘蓝类小孢子密度以2×104～4×104个/mL最适；而王涛涛[1]发现在一定的小孢子发育阶段和添加适量的活性炭时，将密度设为1.5～2个花蕾/mL，有利于大白菜和紫菜薹的小孢子发生，而将密度设为1.5个花蕾/mL有利于甘蓝的小孢子发生。

2 游离小孢子培养技术在育种中的应用研究

2.1 双单倍体育种

在育种中，由小孢子产生的双单倍体(DH,Double haploid)后代是纯系群体，可直接应用于芸薹属作物育种。隐形基因在DH群体中出现的频率(1/2n)是常规育种中F2群体(1/22n)的2n倍(n为基因对数)，能有效提高隐性基因的选择效率。DH系还具有同单粒后代相似的农艺形状和综合特性。Plamer等[26]对绿花菜的DH群体及其杂交种的观察和研究表明，大多数DH系虽然形态、产量不及亲本，但DH杂交种各项性状明显好于亲本和DH系。

芸薹属作物双单倍体品种已陆续育成。耿建峰等[27]利用小孢子培养产生的两个自交不亲和系配制出具有早熟耐热、品种好、抗病性强等优良性状的花椰菜DH杂交种‘豫雪60’；随后他们还选育出早熟高产、抗先期抽薹的春甘蓝DH杂交新品种‘豫生1号’。吴江生等[28]成功育成了我国第一个双低DH甘蓝型油菜品种‘华双3号’。

此外，小孢子培养技术也应用于常规杂交育种和远缘杂交育种中。石淑稳等[29]分别从甘蓝型油菜与诸葛菜(Orychophragmusvlolaceus)的属间杂种进行小孢子培养获得小孢子再生植株，周永明等[30]在甘蓝型油菜与白菜型油菜、甘蓝型油菜与芥菜型油菜的种间杂交中获得了小孢子胚和再生植株，为芸薹属植物远缘杂交和种间育种创造种质资源开辟了新途径。

2.2 突变育种

小孢子具有单倍体和单细胞特性，且群体大，是理想的突变材料。目前应用于芸薹属作物小孢子培养突变体的方法有2类，一类是化学方法，如叠氮化钠(NaN3)、亚硝基尿烷(ENU)和甲基磺酸乙酯(EMS)，另一类是物理方法，如χ射线、γ射线和UV紫外线。UV是被最广泛应用的突变剂。Ahmad等[31]通过UV处理甘蓝型油菜小孢子，表明小孢子对UV极为敏感，并筛选出对油菜黑斑病抗性强的再生植株。曹鸣庆等[10]将大白菜黑斑病毒素加入培养基，诱导得到的小孢子胚中筛选出了对黑斑病表现一定抗性的大白菜小孢子植株。Barro等[32]用EMS诱变埃塞俄比亚油菜(B.carinata)小孢子，再生植株的种子芥酸含量差异很大。

2.3 基因工程育种

外源基因导入游离小孢子并加倍后，可以最大限度的降低转基因植株的嵌合性和杂合性，通过小孢子胚能快速、有效地筛选出含有转基因的胚状体，较大地提高基因的转化效率[33～36]。Dormann等[37]建立了白菜型和甘蓝型油菜分离小孢子根癌农杆菌介导转化系统和无损筛选系统。陈军等[36]以甘蓝型油菜小孢子为受体，利用激光束穿刺法导入芜菁花叶病毒外壳蛋白基因，最终获得1株转化植株。刘凡等[38]利用大白菜小孢子胚状体获得抗草胺膦除草剂转基因植株。随着游离小孢子培养技术的日益成熟，必将推动基因工程的发展。

3 问题与展望

游离小孢子培养技术发展十分迅速，但在理论和应用上仍存在许多问题。其核心问题是小孢子脱分化的启动和胚胎的发育未能完全明了；离体条件下小孢子的发育不同步和多种发育途径并存，使人们难以用先进的现代生物学技术去深入研究小孢子的某些生化过程；虽然芸薹属植物的小孢子培养再生植株普遍具有一定的自然加倍率，这对植物的育种工作非常有利，但小孢子植株的加倍机理仍不明确。此外，现有的研究多局限于培育技术方法方面，在育种中的应用也较少，而芸薹属作物的生育期以及诱导率不高也限制了该项技术的广泛应用。今后应加强理论和技术研究，深入探讨小孢子发育的调控机理，建立程序化的培作，为作物育种改良提供快捷有效的手段。

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2009-07-18

湖北省自然科学基金项目(2007ABA386)；湖北省荆州市科技发展计划项目(20081P033)

刘乐承(1964-)，男，湖北洪湖人，农学博士，教授，主要从事园艺植物育种的教学与研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.018

Q813.1

A

1673-1409(2009)03-S056-04