ＩＦＮ－γ对大鼠创面愈合中Ｓｍａｄ７表达的影响

李　璐　王继华　赵亚南　李允怡

[摘要]目的：将干扰素γ（IFN-γ）应用于大鼠创面，观察创面肉芽组织的生长、成纤维细胞数目，分析IFN-γ对Smad7的影响。方法：选取成年SD大鼠127只，建立大鼠创伤模型。实验分成A、B、C、D、E共5组，每组25只。A组为生理盐水溶剂对照组，B组为IFN-γ 500U /ml溶剂剂量组，C组为IFN-γ 1000U/ml溶剂剂量组，D组为2000U /ml溶剂剂量组，E组为空白组，正常对照组2只，为未损伤的正常大鼠。分别于创伤第3、7、10、14、21日随机选取各组5只大鼠采用过量麻醉处死，剪取创面肉芽组织，分别行HE常规染色，在光学显微镜下观察新生肉芽组织厚度、计数成纤维细胞数。行免疫组化染色，在光学显微镜下观察肉芽组织中Smad7的表达情况。结果：各时间点A、B组肉芽组织厚度较C、D组致密且厚（P＜0.001），E组肉芽组织厚度介于A、B组和C、D组之间，（P＜0.05）；200倍光镜下，目测计数成纤维细胞，伤后第3、21天，各组别成纤维细胞数量无差异（P＞0.05），伤后第7、10、14天，A、B组成纤维细胞数量比C、D、E组明显增多（P＜0.001）；通过图像分析检测Smad7平均灰度和平均光密度。Smad7在伤后第3天、第14天表达较强，在C、D组中各时相的表达强于A、B、E组（P＜0.001），但C组和D组、A组和B组组间比较无差异（P＞0.05）。结论：干扰素γ（IFN-γ）可使新生肉芽组织生长缓慢、成纤维细胞数量减少，延长创面愈合时间，并可使大鼠皮肤创面中Smad7表达增强。

[关键词]大鼠；Smad7；干扰素γ（IFN-γ）；创面愈合

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）02-0201-04

Effects of interferon-γ on and Smad7 in wound healing of rats' skin

LI Lu1，WANG Ji-hua2，ZHAO Ya-nan2，LI Yun-yi3

（1. Department of Breast,the First People's Hospital of Kunming,Kunming 650011,Yunnan,Chnia; 2. Department o Plastic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,Yunnan,Chnia; 3.The Wu'Plastic Hospital of Kunming,Kunming 650000,Yunnan,Chnia）

Abstract:Objective To observe the effect of Smad7 in wound healing of rats' skin, and to investigate the growth of granulation tissue and fibroblast count. To analyze the mechanism of IFN-γ on signal transduction of Smad7.Methods Full thickness excisional wound on the back of rats were used as wound models. The rats were divided randomly into 5 groups as follows;①solvent control [saline solution (0.9% NaCl), group A]; ②IFN-γ500U/ml [group B]; ③IFN-γ1000U/ml[group C]; ④IFN-γ2000U/ml[group D]; ⑤blank control [group E]. And 2 rats were compared as normal control. Wound tissues were collected on the 3rd,7th,10th,14th and 21st postwounding days. All specimens were dealed with by the pathology tectology (HE) and immunohistochemistry staining technique (SP) to observe the growth of granulation tissue, fibroblast count, the expression level of Smad7.ResultsThe growth of granulation tissue and fibroblast count of groups C and D were less than groups A and B at the same day (P<0.001). But on the 3rd and 21st day after wound, there were no differences all the groups on fibroblast count (P>0.05). Image analysis showed that there were markable difference of Smad7 among the groups A,B and groups C,D (P<0.001), Group E was between them (P<0.05). The expression of Smad7 on 3rd and 14th days after wound was higher than other days (P<0.05).ConclusionIFN-γcan make growth of granulation tissue slow down and make fibroblast count reduce in wound healing of rats' skin. After administration, the expression of Smad7 is enhancing

Key words: rat; Smad7; IFN-γ; Wound healing

创面愈合是一个复杂的生物学过程，有多种组织修复细胞、细胞外基质成分以及各种调控因素的参与，这些相关因素形成网络共同调控创面的愈合。在调控创面愈合众多因素中，Smads通过介导转化生长因子β（transforming growth factor-β、TGF-βs）超家族的细胞内信号传导，而在创面愈合的网络调控机制中起到不容忽视的作用。本研究通过对大鼠创面模型局部外用TGF-β/Smads拮抗剂IFN-γ，了解Smad7在大鼠创面愈合过程中的变化规律。

1材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：干扰素γ（IFN-γ）购自上海克隆生物高技术有限公司、Smad7抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。S-P即用型试剂盒、DAB显色液、PBS液（pH= 7.2～7.4）购自福州迈新生物技术开发有限公司。BH-2型OLYMPUS光学显微镜、LKB-B型超薄切片机、CM2000Ｃ北航医学病理图像分析仪等由昆明医学院基础学院病理教研室提供。

1.2 实验动物及分组：选取成年SD大鼠127只，雌雄不限，体重0.18～0.2kg。随机分成A、B、C、D、E共5组，每组25只，正常对照组2只，单笼饲养。所有手术操作均在无菌条件下进行，以30g/L戊巴比妥钠（35mg/kg）腹腔注射麻醉，将大鼠背部两侧剪毛，常规术前准备消毒。在大鼠背部剪去四块大小为1cmx1cm的全层皮肤，形成缺损，创面间隔2cm，125只大鼠无死亡。每日分别外用IFN-γ溶液 和0.9%生理盐水换药：A组用0.9％生理盐水；B组用IFN-γ500U/ml溶液；C组用IFN-γ 1000U/ml溶液；D组用2000U/ml溶液；E组为空白组，即伤后不作任何处理。

1.3 取材和染色：分别于术后第3、7、10、14、21日随机选取各组5只大鼠采用过量麻醉处死，剪取创面肉芽组织，范围包括周围正常组织，深达肌层。分别行苏木素－伊红常规染色（HE染色）和免疫组化染色。观察HE染色切片，40倍光镜下选取不重叠的三个视野，以计算机显微测微尺测量新生肉芽组织厚度，同法在200倍光镜下，目测计数成纤维细胞。免疫组化染色（SP染色）后，在高倍镜（×400）下，用图像分析仪对Smad7阳性细胞进行平均光密度、平均灰度的测量。

1.4 统计学处理：数据用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS13.0 for windows 统计软件包进行方差分析和两两比较q检验，处理检验水准α为0.05，P<0.05差异具有显著性。

2结果

2.1 新生肉芽组织厚度：40倍光镜下观察，各组别新生肉芽组织于术后第3天开始形成，厚度于术后第7天增厚明显，第10天达峰值，第14天开始下降，第21天接近正常大鼠皮肤。各时间点A、B组肉芽组织厚度较C、D组致密且厚，组间比较差异具有显著统计学意义（P＜0.001）。E组肉芽组织厚度介于A、B组和C、D组之间，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 成纤维细胞计数：200倍光镜下，在创面肉芽组织中选取3个不重叠视野，目测计数成纤维细胞，术后第3、21天，各组别成纤维细胞数量无差异（P＞0.05）。伤后第7、10、14天，A、B组成纤维细胞数量比C、D、E组明显增多（P＜0.001）。各组内成纤维细胞数均在第10天达到高峰，不同时间点成纤维细胞计数差异具有显著性（方差分析P＜0.001）。

2.3 创面愈合中Smad7的表达：免疫组化染色后，成纤维细胞胞浆、胞核均呈阳性染色，即呈浅棕色至棕黑色细颗粒状，新生毛细血管内皮细胞胞浆呈浅棕色。Smad7在术后第3天、第14天表达较强，在成纤维细胞胞浆和胞核内呈强阳性表达，在C、D组中各时相的表达强于A、B、E组，差异有显著性（P＜0.001），但C组和D组、A组和B组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Smad7在E组中各时相的表达均介于C组和D组、A组和B组之间，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

各时相Smad7平均灰度如表4示：C、D组与A、B组之间差异有显著性（P＜0.001）,E组分别与A、B组和C、D组之间存在差异，经统计学分析有意义（P＜0.01）。但是，A组和B组间，C组和D组间差异无统计学意义（P＞0.05）。Smad7的表达于伤后第3、14天最强，第7天表达最弱。

3讨论

Smad Smad是Mad和Sma蛋白及其类似物的统称,即Smad(Sma-Mad)族蛋白，是细胞内特异转导TGF-β调控信息的信号传递分子[1]。目前,已发现8种Smad分子,其中Smad2,3,4,6,7与TGF-β的信号调控最为密切。这5种Smad按其功能分为3类:①受体调节Smad，即Smad2与Smad3。配体与受体结合后,即能磷酸化Smad2,Smad3使其激活；②共用Smad,即Smad4。Smad2与Smad3激活磷酸化后必须与Smad4形成复合物,才能迁移至胞核中促进靶基因表达；③抑制性Smad,包括Smad6和Smad7。

目前对于Smad7阻断TGF-β信号通路,开展对器官纤维化的实验研究已引起广大学者的极大兴趣。近来有作者[2]将含有小鼠Smad7cDNA的重组腺病毒载体导入由博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化模型体内,发现ColⅠmRNA、羟脯氨酸含量降低及组织病变程度减轻。Terada等[3]也通过构建Smad7基因的病毒载体实施对肾纤维化动物模型作基因治疗的尝试,发现Smad7可抑制肾间质纤维化的程度。王丹茹等[4]，将外源的Smad7基因转入细胞内,加强内源Smad7的作用,阻断通路,有效地下调了TGF-β的细胞内信号传导，减少其自身基因表达。Smad7的表达可以受到其它信号转导通路的调节，比如, IFN-γ通过Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1转录因子可以增强Smad7的表达,这就可以解释TGF-β和IFN-γ在调节免疫细胞功能时的相互拮抗作用。因此，增加IFN-γ可通过 Jaks-Stats通道上调Smmad7，而达到抑制TGF-β的作用。

由结果可知，与新生肉芽组织厚度和成纤维细胞计数结果相一致的是：局部外用IFN-γ（1000U/ml或2000 U/ml）可使创面内成纤维细胞数量减少、新生肉芽组织厚度减少、创面愈合时间延长。因此，我们可推测IFN-γ对于创面愈合的影响可能是通过以下途径实现的：抑制成纤维细胞的生长增殖，导致新生肉芽组织厚度减少、增生缓慢，从而影响创面愈合。

本实验可看出，使用外源性IFN-γ后，Smad7在剂量组C组（1 000U/ml）和D组（2 000 U/ml）中的表达较A组（盐水组）、B组和E组（空白组）增强。B组（500U/ml）与A组（对照组）比较各指标都无统计学意义，而C、D组各指标值均比A组或B组有降低或减少，表现出显著的统计学差异，可能C组（1 000U/ml）是大鼠创面组织发生变化的有效起始浓度。当IFN-γ浓度增加到D组（2 000U/ml）时仍然对创面组织产生明显的作用，但是和C组比较没有明显的差别。

实验结果显示，外用IFN-γ后，C组和D组Smad7表达强于A组和B组，由此可认为当外用IFN-γ在浓度为1 000U/ml和2 000U/ml时可通过Jak-Stat通路上调Smad7。IFN-γ在浓度为500 U/ml时，可能由于浓度较低未达大鼠创面用药的起始浓度。空白组E组在创面不做任何处理的情况下，Smad7的表达仍强于A、B组（P＜0.05），这可能是于E组在创面自然愈合过程中，由于炎性反应较A组和B组强，部分炎性因子如：白细胞介素-1（ IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）也可通过NF/RelA转录因子刺激Smad7的表达，从而阻断TGF-β1的信号传导。

由实验结果可看出，各组内Smad7平均光密度和平均灰度的改变基本呈一致性。Smad7在伤后第3天、第14天表达较强，在成纤维细胞胞浆和胞核内呈强阳性表达，于第21天下降达正常水平。由于目前对于大鼠皮肤创面通过局部外用IFN-γ来阻断TGF-β/Smad通路尚无报道，因此，可在今后实验研究中进一步探讨其药理规律。有目的地调控和干预TGF-β/Smad信号转导途径,有助于促进创伤愈合与胚胎发育,减轻瘢痕及纤维疾病,加深对肿瘤发生、发展的理解和认识[5]。

[参考文献]

[1]Roberts AB.TGF-beta signaling from receptors to nucleus[J]. Microbes Infect, 1999, 1:1265-1273.

[2]Nakao A, Fujii M, Matsumura R, et al. Transient gene transfer and expression of Smad7 prevents bleomycin-induced lung fibrosis in mice[J]. J Clin Invest, 1999, 104-105.

[3]Terada Y, Hanada S, Nakao A, et al .Gene transfer of Smad7 using electroporation of adenovirus prevents renal fibrosis in post-ob-structed kidney[J]. Kidney Int Suppl,2002:61,94.

[4]王丹茹,刘伟. Smad7过度表达抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达[J]. 基础医学与临床,2003,23(1):35-38.

[5]杨力,李荟元. Smad蛋白家族与TGF-β信号转导[J]. 中国美容医学,2001,10(6):547-549.

[收稿日期]2008-09-18[修回日期]2009-1-5

编辑/张惠娟