不同抗原致敏树突状细胞对荷瘤大鼠经射频消融后免疫机能的影响

文艳玲　罗葆明　智　慧　冯　霞　杨海云　梁碧玲

【摘要】 目的 本研究在大鼠Walker 256实体瘤射频消融术（RFA）后应用不同肿瘤抗原致敏的DC瘤苗，探讨其对大鼠抗肿瘤免疫的不同影响。方法 38只荷Walker 256实体瘤SD大鼠随机分成3组：对照组行RFA治疗，实验组1行RFA＋冻融抗原致敏DC治疗，实验组2行RFA＋热休克冻融抗原致敏DC治疗。治疗前及治疗后第4天分别测量各组大鼠外周血中CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞及CD4+ /CD8+比值，记录大鼠的荷瘤生存期。结果 治疗后各组荷瘤大鼠外周血中CD8+T细胞均呈下降改变，其中，下降的程度为实验组2>实验组1>对照组（P<0．05）；CD4+/CD8+比值的变化，实验组2的升高与其他两组相比差异有统计学意义 (P<0．05)；实验组1的升高与对照组比差异无统计学意义（P>0．05）。荷瘤生存期：实验组2>实验组1>对照组（P<0．05）。 结论 在RFA后应用不同抗原致敏的DC可不同地程度改善大鼠的抗肿瘤免疫，冻融热休克抗原致敏DC较未热休克冻融抗原致敏DC能更有效地激发荷瘤大鼠的抗肿瘤免疫机能。

【关键词】树突状细胞；射频消融；免疫お

Immunological influence of different pulsed dendritic cells on rats after radiofrequency ablation

WEN Yan-Ling, LUO Bao-Ming, ZHI Hui, et al.

Department of Ultrasound, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangdong 510120， China

【Abstract】 Objective Dendritic cell (DC) lose the nomal function in tumor host. The tumor-antigen pulsed DCs obtained in vitro can effectively improve the immulogical state. The purpose of this study is to invest the immunological influence of different pulsed dendritic cells (DCs) on rats after radiofrequency ablation (RFA) of the tumor.Methods 38 rats with Walker 256 solid tumor were divided into four groups: control groupwas treated with RFA only; experimental group 1was treated with un-heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs after RFA; experimental group 2was treated with heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs after RFA. Before treatment and 4 days after treatment, the CD4+ T cell and CD8+ T cell were checked with cytometric analysis, and CD4+/CD8+ were evaluated. The suvival duration of the rats were recorded. Results After treatment, For the degree of the decrease of CD8+ T cell, there were significant difference between the different group with the degree of group 2 > group 1 > control (P<0．05). The survival duration of the rats in group 2 is the longest and then that of group 1 (P<0．05). Conclusion Using different antigen-pulsed DCs can improve the antitumor immunological function of the rats after RFA. Heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs can more effectively do that than un-heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs.

【Key words】Dendritic cell; Radiofrequency ablation; Immunology

在肿瘤治疗当中进一步激发、增强机体对肿瘤的主动免疫反应，有可能在延缓肿瘤生长、杀灭体内微小转移灶或残留癌细胞、防止肿瘤复发和转移等方面起到重要的作用^[1-2]。树突状细胞（DCs）是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，具有强大的激活初始型T细胞的能力，是目前肿瘤免疫治疗的研究热点之一。本研究在荷瘤大鼠实体瘤经射频消融（RFA）治疗后应用不同抗原致敏的DC瘤苗，旨在探讨不同的DC瘤苗对荷瘤大鼠抗肿瘤免疫机能的影响。

1 资料与方法

1．1 实验动物及实体瘤模型的制备

1．1．1 实验动物 SD大鼠38只，体质量80~100 g，雌雄不限，购自广州中医药大学实验动物中心。

1．1．2 实体瘤模型的制备 将Walker 256细胞（购自第二军医大学长海医院）悬液注入大鼠腹腔，约7 d后获得大鼠Wakler 256腹水型肿瘤模型；抽取约1 ml 腹水（血性为佳）注入大鼠右侧腋窝皮下，5 d后获得大鼠Walker 256实体瘤模型。

1．1．3 实验分组 将成瘤大鼠随机分成3组： 对照组（n =10），行RFA治疗；实验组1（n =10），行RFA＋冻融抗原致敏DC治疗；实验组2（n=18），行RFA＋热休克冻融抗原致敏DC治疗。

1．2 DC瘤苗的制备

1．2．1 DC的培养及鉴定 断颈处死大鼠后，以75 ％酒精浸泡10 mim，取大鼠后腿股骨及胫骨，PBS液冲洗骨髓腔，经离心及红细胞裂解液等处理分离获骨髓单核细胞，培养液加入细胞因子rGM-CSF 5 ng/ml和IL-4 5 ng/ml（R＆D 公司），置于培养箱中培养，隔天进行半量换液。收集培养8 d的DC行Giemsas染色光镜下观察；同时收集DC进行流式细胞免疫学检测表面特异性抗原OX6、OX62和细胞因子CD86、CD80。

1．2．2 DC瘤苗的制备和检验 Walker 256细胞株离心后42 ℃温浴1 h（热休克）,反复冻融，或未经热休克处理的Walker 256 细胞反复冻融后，离心，取上清，－80℃冰箱保存备用。DC培养第7 天加入预先制备的肿瘤抗原，置于培养箱中培养，隔天收集。体外进行混合淋巴细胞反应试验和MTT法淋巴细胞杀伤试验。

1．3 实验方法

1．3．1 治疗 10%水合氯醛腹腔注射（0．25 ml/100 g体质量）麻醉大鼠，冷循环射频治疗系统（Radionics Co． 美国）治疗实体瘤，发射功率60 W，治疗时间2 min。治疗后于实体瘤旁皮下分别注入不同DC，注射细胞数为1×106个，单纯射频组同样方法注入等量生理盐水。

1．3．2 观察指标 治疗前及治疗后第4天分别测量各组大鼠外周血中CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞及CD4+ /CD8+比值，记录大鼠荷瘤生存期。

1．4 统计学方法 实验结果均采用SPSS 13．0统计软件分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，以 Log-rank test 进行组间比较，两样本均数的比较采用t检验，P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

骨髓来源大鼠DC培养8 d 后收集，Giemsas染色可见细胞形态不规则，细胞表面具有DC的特征性突起，流式细胞仪检测：经冻融抗原致敏DC其OX6+表达率为78．25％、OX62+表达率为86．36％，CD80⁺为61．52％，CD86+为69．08%。经热休克冻融抗原致敏DC其OX6+表达率为86．24％、OX62+表达率为92．17％，CD80⁺为70．16％，CD86+为86．21%。

混合淋巴细胞反应试验表明DC可以诱导同种异体淋巴细胞的强烈增殖，其中热休克冻融抗原致敏DC瘤苗的作用明显高于未热休克冻融抗原致敏DC（P<0．05）；同时，DC瘤苗能诱导有效的CTL反应，其中热休克冻融抗原致敏DC组的细胞毒作用较强，与冻融抗原致敏DC组比较差异有统计学意义（P<0．05）。

腋下接种5 d后大鼠实体瘤二维超声显示为低回声结节，边界清，长径平均约9．47 mm；治疗前各组大鼠实体瘤体积比较差异无统计学意义（P>0．05）。

治疗前后各组大鼠外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+比值的变化见表1。实验组2外周血CD4+T细胞的升高较实验组1及对照组显著（P<0．05）；实验组1外周血CD4+T细胞的升高较对照组比稍明显，但差异无统计学意义（P>0．05）；治疗后各组荷瘤大鼠外周血中CD8+T细胞均呈下降改变，其中，下降的程度为实验组2>实验组1>对照组（P<0．05）；CD4+/CD8+比值的变化，实验组2的升高与其他两组相比差异有统计学意义（P<0．05）；实验组1的升高与对照组比较差异无统计学意义（P>0．05）。

大鼠荷瘤生存期：对照组：（9．0±1．4）d，实验组1：（13．1±2．8）d，实验组2：（16．6±5．4）d。实验组2>实验组1>对照组（P<0．05）。

3 讨论

DCs的功能失常在肿瘤对宿主的免疫逃避中起重要作用，通过体外途径获得功能正常的DCs并应用于治疗是当前生物治疗的研究热点之一。既往的研究当中，利用各种技术在体外培养并获得对特殊抗原致敏的DC瘤苗，该类DCs瘤苗在回输体内后，能有效地刺激机体的T细胞增殖，从而在恶性黑色素瘤、肝癌等肿瘤的治疗中取得了一定的疗效^[3-4]。其中采用全肿瘤细胞冻融产物在体外致敏DC因其含肿瘤抗原全面，无须知道特殊的抗原表位，成功地制备了能刺激T淋巴细胞增殖并诱导产生特异性CTL应答的DC瘤苗^[5]。

热休克蛋白（heat shock protein， HSP）是一组特殊的肿瘤抗原，此组蛋白具有较强的抗原性，能被DCs表面的特殊HSP受体和MHC-I类分子识别并递呈给T淋巴细胞，从而强烈地刺激DCs成熟并诱发特异而强大的抗肿瘤免疫^[6]，本研究结果表明，由经热休克处理的冻融肿瘤抗原致敏DCs后，DC表面特异性抗原和MHC分子的表达上调，并可以进一步激发DCs的免疫功能，从而诱导出了较单纯冻融肿瘤抗原致敏DCs更强的T淋巴细胞反应和特异性CTL应答。

近年，RFA在肝肿瘤等方面的应用取得了较好的近期和中远期疗效，在RFA治疗过程中，肿瘤细胞经热效应和空化效应的作用发生凝固性坏死并导致肿瘤抗原暴露的增加和大量热休克蛋白的产生，从而可以在一定程度上刺激机体的抗肿瘤免疫机能^[2]。本研究中热休克冻融抗原致敏DC瘤苗在抗原处理过程中进行了热休克处理，模拟RFA治疗过程肿瘤蛋白变性的过程；在RFA治疗后使用经热休克冻融抗原致敏的DC可特异性识别热休克蛋白并将之递呈给T淋巴细胞，从而激发出较单纯冻融抗原致敏DC更强的免疫反应。

在T淋巴细胞群中，CD4+T辅助细胞参与细胞免疫应答，并对B淋巴细胞的活化增殖具有重要辅助作用，同时在调节记忆性CD8+T细胞的分化增殖中起重要辅导作用；而在肿瘤机体中，CD8+T细胞可以通过与DC的直接接触改变DC共刺激分子的表达或通过分泌IFN-γ、IL-6、IL-10等而发挥免疫抑制作用。多项对肿瘤患者外周血的研究表明^[7-8]，肿瘤机体中CD4+T辅助细胞明显下降，而CD8+T细胞比例异常升高，CD4+/CD8+比值显著低于正常机体。本研究结果表明RFA治疗后应用DC瘤苗能有效地刺激荷瘤大鼠外周血CD4+T细胞的上升、CD4+/CD8+比值的上升、以及CD8+T细胞的下降，其中经热休克冻融抗原致敏DC瘤苗较单纯冻融抗原致敏DC瘤苗效果更显著（P<0．05），而该组大鼠实体瘤的生长速度明显减慢，荷瘤大鼠生存期显著延长，提示经热休克冻融抗原致敏DC瘤苗在改善机体免疫状态，延缓肿瘤生长中较单纯冻融抗原致敏DC具有更好的作用。

参考文献

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