走近绿色荧光蛋白

鲁恒星　华朝阳

摘要以高中生物教材为切入点，以诺贝尔化学奖为背景，从来源、分子结构、发光机制、研究历程以及在生物技术中的应用等方面对绿色荧光蛋白进行了概述。

关键词荧光现象绿色荧光蛋白荧光标记

中图分类号Q-49文献标识码E

现行高中生物教科书(人教版)中，多处描述了荧光标记技术，并有有关荧光蛋白的描述，如荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验、荧光标记技术与基因定位、荧光鼠的培育等。2008年10月8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。于是，笔者搜集并整理了有关资料，从绿色荧光蛋白(GFP)的来源、分子结构、发光机制、研究历程以及在生物技术中的应用等方面进行概述。

12008年诺贝化学奖及获奖者简介

日本的下村修、美国的马丁·沙尔菲和美籍华人钱永健于2008年10月8日，因对绿色荧光蛋白(GFP)的研究，分享了今年的诺贝尔化学奖。他们的研究历程，犹如一场接力跑：下村修发现了GFP，沙尔菲确定了它的应用价值；而钱永健则让它变得多样化。

下村修现年80岁，生于京都，长于长崎。1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962年他发现荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。从33岁做出重要发现，到46岁完成全部关键实验，他的研究遥遥领先，却一直默默无闻。2001年退休后，年逾七旬的下村修继续在家里的地下室潜心研究。

马丁·沙尔菲现年61岁，美国哥伦比亚大学生物学教授，他在利用绿色荧光蛋白做生物示踪分子方面做出贡献。

钱永健1952年出生于美国纽约，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫奖医学奖得主。他发明的多色荧光蛋白标记技术，将为细胞生物学和神经生物学发展带来一场革命。

2荧光现象

一些化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能、x线或阴极射线等)而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式散失(即发光)，这种现象就是荧光现象。可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光。而一旦停止供能，发光(荧光)现象也随之瞬间消失。

3绿色荧光蛋白(GFP)的来源、分子结构和发光机制

绿色荧光蛋白最初在海洋无脊椎动物——维多利亚多管水母中被发现。野生型的GFP的分子量约为27kD，单链，由238个氨基酸残基组成。GFP具典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，由周围11个β-折叠片围绕中央1个α-螺旋构成，发光中心位于中央的α-螺旋结构中，严密的桶形结构保护着发光中心，防止它被周围环境淬灭。GFP的发光中心由六肽组成，发光团是其中的Ser65-Tyr66-Gly67三个氨基酸残基经过环化、脱氢后形成的咪唑环。发光中心周围的残基与发光中心相互作用对GFP发光产生影响。GFP这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。GFP的真正的发光部位为咪唑环上的阴离子酚，Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。野生型GFP有2个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，两种波长的任何一种光激发均可使GFP产生509nm的绿色荧光。

尽管野生型GFP能发出很绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好，在37℃不能正确折叠等。研究人员通过定点或随机突变，不断地改造发光基团周围的残基，得到了多种改良型的GFP。S65T点突变获得的GFP，光谱性质显著提高，荧光强度和光稳定性也大大增强，激发峰转移至488nm，而发射峰仍保持在509nm，使GFP的应用潜力得到有效提高；F64L点突变获得的GFP，在37℃的折叠能力得到改善；颜色突变获得多色荧光蛋白，如蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白；另外，还获得了对pH敏感的突变体等。目前，GFP家族已经变得绚丽多彩。

4绿色荧光蛋白的研究历程

GFP发光不同于萤火虫发光，萤火虫是由荧光酶催化底物分子——荧光素以后产生荧光；而GFP发光是蛋白质本身发光，无需底物。之前就有人研究生物发光现象，蛋白质本身发光的研究则源于下村修和约翰森的发现。

1955年，有人发现水母可以发绿光，但不知其因。1962年，下村修和约翰森从水母中分离生物发光蛋白——水母素时，意外地发现了一个副产物——GFP，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。1974年，他们得到了这种蛋白质。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移在生物中的发现。水母素是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光，而GFP是蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。

下村修做GFP研究时只是对生物发光好奇，而对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。1992年，有人拿到了水母素和GFP的cDNA。有了基因序列，很多人尝试将GFP表达到其他生物体中，但都失败了。1994年沙尔菲利用PCR技术扩增了GFP的编码区，成功地将它克隆到大肠杆菌和线虫细胞中，通过紫外线或蓝光激发，均产生了很美妙的绿色荧光。首次证实了GFP作为发光标记物用于生物学研究的价值，这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破。

沙尔菲的研究立即引起轰动，许多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的研究对象。从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先但很少有人注意。在1974年以后的后继工作，主要是跟风研究，其中例外的是钱永健的工作。

1994年，钱永健通过定点或随机突变，首次完成对GFP发光基团周围残基的重大改造，从而改进了GFP的发光强度、发光颜色，使GFP家族变得绚丽多彩。目前，世界上使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。他发明了更多应用方法，阐明了发光原理。

5应用与展望

GFP在多种条件下稳定，分子量小；GFP基因序列较短，可以与其他基因一起构建到载体上进行高效转化；GFP基因没有物种特异性，在原核、酵母、植物以及动物细胞中都获得了成功表达，大量表达对细胞没有毒性；GFP荧光稳定，适用于定量测定与分析。GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，通过常规的基因操纵手段，用荧光蛋白来标记目标蛋白，可跟踪和判断生物细胞的分子变化。因此人们将绿色荧光蛋白喻为生物化学中的“北斗星”。21世纪初，在它的指引下，人们深入到大片未知的科学处女地，看到了以前所不能见的新世

界，研究成果层出不穷。

5.1目标蛋白的位置及动态变化的观察

利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转入合适的细胞进行表达，然后通过荧光显微镜，借助闪闪发光的标签工具(GFP)便能观察到令人感兴趣的、通常肉眼看不见的蛋白的运动、定位及它们之间的互动。利用这项技术科学家已经加深了对细胞细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等过程的了解。其中，做得最漂亮的当属“脑虹”实验，即对3种不同颜色的GFP加以调配，变成6种颜色，然后将它们分别“转移”给不同神经细胞，用以观察它们的生长过程及其相互关系。一些实验室甚至“生产”出了可人为控制颜色的荧光鱼、荧光鼠、荧光猪等。

5.2细胞器的标记

GFP在接上各种细胞内定位序列后，在活体中可直接观察各种亚细胞结构及其生活状态。已有大量实验报道表明GFP可定位到细胞核、线粒体、内质网、质膜及核膜孔等。各种基因突变体的产生也使得定位在很小区域内的GFP能很灵敏地被检测到。同样，利用GFP能在各种亚细胞结构中表达的特性可以研究某些序列的定位特性及分析定位序列的结构特征等。

5.3DNA标记

GFP除了可标记蛋白质外，也可用于标记DNA。细菌lae阻遏蛋白(laeI)能与它的目标DNA(lae操纵子，lacO)紧密和特异结合，用GFP与laeI可构建产生laeI-GFP，将laeO序列插入到细胞的基因组中，然后在活细胞中可直接观察laeI-GFP与laeO的共定位地点，利用这种技术已成功地在哺乳动物细胞、酵母及细菌中活体标记了DNA序列。

5.4分析病原物与宿主关系

传统方法必须在分析前对组织进行处理，但这样就阻止了感染的继续进行。GFP的出现可有效地克服这一弊端。研究表明，移动蛋白MP对病毒的细胞间移动是绝对必需的。将GFP与TMV(烟草花叶病毒)的MP融合，可用来跟踪MP在亚细胞间的移动、监测MP分子与宿主蛋白的关系及分离与之相互作用的成分等。运用这种方法人们可以跟踪病原物对宿主的感染途径，研究病原物与宿主的相互关系、药物的作用情况等。

5.5药物筛选

新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出科学家所感兴趣的药物。在细胞内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子与某受体结合后的迁移，而这一迁移过程通常与细胞的某生理功能有关。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断哪些化合物具有与信号分子相似的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。

5.6融合抗体

近20年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体(杂交瘤技术——单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体。融合抗体属基因工程抗体，它具有与抗原结合及发射荧光两种特性，由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如大肠杆菌中表达。若能成功解决其表达问题，则融合抗体将在免疫染色及肿瘤检测这一领域扮演极为重要的角色。

5.7生物传感器

利用蛋白质工程技术将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上可以设计生物感受器。绿色荧光蛋白以其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca²感受器，原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具。将来，GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。

不过荧光蛋白也存在着一些不足，主要表现在GFP从表达到成为具有荧光活性形式的过程比较慢，因而对某些细胞动力学过程不能实时监测，检测的灵敏度也需要进一步提高，某些细胞的萤光背景会影响GFP的检测。但随着对GFP研究的深入，预计将会有更多突变改进型的GFP出现，可以逐步克服上述的一些缺点，推动GFP在生命科学研究中更广泛的应用。21世纪是生物学世纪，在绿色荧光蛋白与其他技术变革的共同推动下，这个预言将真正有可能成为现实。