不同种子细胞在组织工程膀胱构建中应用的研究进展

朱卫东 徐月敏

不同种子细胞在组织工程膀胱构建中应用的研究进展

朱卫东 徐月敏

组织工程膀胱构建的研究为膀胱缺损的修复提供了新的选择，它避免了传统的肠道代膀胱引起的代谢紊乱、感染、结石形成等并发症。组织工程膀胱构建研究中，种子细胞的选择、体外培养及扩增是关键，是成功构建组织工程膀胱必不可少的条件[1]。理想的种子细胞应该具备来源广泛、易获得，体外易于培养扩增，与支架材料相容性好等优点。本文主要就不同的种子细胞在组织工程膀胱构建研究中的应用进展进行综述。

1 自体成体细胞

通过膀胱组织活检，获取一定数量的自体成体细胞，操作简单，损伤小。在研究早期，正常的上皮细胞可以在实验室生长，但在体外难以大量扩增，老化问题难以克服，从而限制了研究的进展。2006年，D iego等[2]通过角质上皮培养技术使得移行上皮细胞在体外得到了大规模扩增，大大加速了膀胱组织工程的研究进展。同时，体外培养的上皮具有抵抗尿液基本成分的屏障作用，适用于组织工程膀胱的构建，更加推动了组织工程膀胱研究的发展。Kurzrock等[3]将小鼠3T3细胞作为膀胱上皮细胞（Urothelial cells，UROs）原代培养的滋养层细胞，成功地将大鼠UROs体外连续培养超过10代，并且冷藏和复苏对UROs的活性无明显影响。Moriya等[4]将UROs与膀胱黏膜下层（Bladder acellular matrix graft，BAMG）复合培养后，异位回植到膀胱部分切除的大鼠的肠系膜上，术后7 d，α-SMC-actin或索蛋白（Desmin）阳性的间质细胞长入BAMG，透射电镜下此间质细胞为肌纤维母细胞，术后14 d和28 d转变为平滑肌样细胞，术后56 d，进一步转变为纤维细胞。这说明长入BAMG的间质细胞逐渐失去平滑肌细胞的特点，单纯UROs存在的环境不能维持平滑肌样间质细胞的表型。Frey等[5]将膀胱上皮细胞和平滑肌细胞混合后种植于合成的水凝胶支架上进行联合培养，证明分层培养和“三明治”样培养技术能诱导有序的细胞排列、有规律的假覆层尿路上皮形成和增加多层的平滑肌基质，而单独种植平滑肌或者尿路上皮细胞都没有观察到细胞长入支架。Asharf等[6]将猪的膀胱上皮细胞及平滑肌细胞接种于去黏膜结肠用于构建膀胱组织，修补膀胱缺损。结果显示修补区域被完整的上皮组织覆盖，而无纤维化形成。而单纯用去黏膜结肠修补则会形成大量瘢痕，且修补区无上皮组织覆盖。因此，他们认为接种细胞能够抑制内在的纤维化和去黏膜结肠的挛缩。Han等[7]采用酶消化法得到膀胱平滑肌细胞，可以在体外大量扩增且能保持其原本细胞形态学、生物学特征，同时能与支架很好地黏附，为获得更好的平滑肌细胞作为种子细胞提供了途径。

Udo等[8]学将膀胱冲洗液离心，沉淀后得到的细胞用表皮生长因子培养液体外培养，能够形成复层的上皮结构，表达AE1/AE3等上皮特异性抗体。

除了泌尿系统本身细胞，以自身的其他组织的细胞作为种子细胞进行膀胱构建研究也有报道。Lai等[9]将兔小肠的平滑肌细胞作为种子细胞在体外扩增后用于膀胱构建，与膀胱平滑肌细胞相比，在免疫组化、收缩性及形成的膀胱容量等方面均无明显差异。因此，他们认为小肠的平滑肌细胞同样可以作为组织工程膀胱构建的种子细胞，且具有来源广泛，数量多等优点。Bernhard等[10]将猪皮肤完全分化的角化上皮和成纤维细胞分别体外扩增后接种于自体带血管蒂去黏膜回肠片的两面以构建膀胱，术后3个月检测其挛缩率为6.5%，新构建的膀胱壁的膨胀性稍差，且没有形成结石等并发症。

2 干细胞

很多病理情况下，如膀胱外翻、膀胱发育不全及膀胱恶性病变时，自体膀胱组织不能提供正常功能的种子细胞。最近亦有研究发现，体外培养的神经性膀胱患者的膀胱平滑肌细胞（Bladder smooth muscle cells，BSMCs）生长、分化、黏附及收缩性能均较正常BSMCs差，也不适合作为组织工程膀胱的种子细胞来源[11]。另有研究认为，正常的自体成体细胞有许多不足，如体外培养增殖速率过慢、体外培养后其原有功能会出现明显降低等[12]。干细胞在一定程度上弥补了上述缺陷。干细胞具有高度增殖和自我更新能力，且具有多向分化潜能，是理想的种子细胞来源。目前，由于医学伦理方面存在着争议，胚胎干细胞在组织工程膀胱构建方面的研究几乎处于空白，研究焦点主要聚焦于各种成体干细胞，其中间充质干细胞是研究最为广泛的。其取材范围包括脂肪组织、骨膜、滑囊囊壁、肌肉、真皮、骨髓等。其中通过骨髓穿刺抽取所获得的骨髓间充质细胞，易培养，便于筛选，且可以向软骨细胞、成骨细胞、表皮细胞、神经细胞和其他一些间充质来源的组织细胞分化[13-14]。Hegnera等[15]证明骨髓源性的干细胞在体外可以向平滑肌细胞进行分化，表达出平滑肌肌动蛋白等平滑肌细胞所特有的标记，为间充质干细胞进一步在组织工程膀胱中的应用提供了很好的思路。

Zhang等[16]采用犬骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）来构建膀胱组织，结果显示构建组织在体外呈现钙离子依赖性收缩反应，收缩性与膀胱平滑肌相似，且同样表达α-SMC-actin等平滑肌特异性标记物；植入犬体内后10周，可有平滑肌束生成。Chung等[17]将33只小鼠分为4组，一组为对照组，一组为部分膀胱切除加单纯缝合组（OG），一组用单纯SIS进行膀胱扩大重建（USG），剩余一组采用骨髓间质干细胞-SIS复合物行膀胱扩大术（SSG）。术后1个月发现，在USG组和SSG组中出现与对照组相同的紧密细胞群，而在SSG组中更可见到基底细胞层中有明显增生的尿路上皮细胞。3个月后，各组中均出现了尿路上皮的增生和肌束的形成，同时还伴有神经染色阳性。RT-PCR发现，SSG组中CⅠ、CⅢ和MHC的含量明显高于USG组。

脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)取材方便，来源广泛，且比其他成体干细胞具有更高的增殖率及向其他类型细胞的分化能力[18]。Gregory等[19]将经绿色荧光蛋白标记的脂肪干细胞注入大鼠膀胱壁内，4周后发现经标记的脂肪干细胞长入膀胱壁的平滑肌内，12周后表达α-平滑肌肌动蛋白等平滑肌特异性标记物。

Shing等[20]将肌源性干细胞(Muscle-derived cell)种植于SIS之上，证实肌源性干细胞可以在无细胞基质上生长并能提供一定的张力,为其作为组织工程膀胱的种子细胞提供了可能。Yokoyama等[21]将鼠的肌源性干细胞分离培养后，分别回注膀胱左右侧壁，于5 d、35 d、70 d分别取出膀胱壁行重型肌球蛋白链及β-半乳糖苷酶染色，显示均为阳性，证实注入的细胞可以长期存活，并可以转化为平滑肌。

Oottamasathien等[22]将经扩增的尿路上皮细胞与孕14 d的胚胎小鼠的膀胱间充质细胞复合，片状埋入免疫缺陷小鼠的肾周，28 d后取出。通过免疫组化染色发现，有成熟的尿路上皮细胞和间质细胞的分化。而单独种植尿路上皮细胞和膀胱间质细胞均没发现膀胱组织。

Ominic等[23]为胚胎源性的干细胞与膀胱平滑肌细胞、尿路上皮细胞共同培养，或者各自单独培养。8 d后显示，干细胞单独培养的生长速度为0.3～0.7 mm/d，与之同样培养的平滑肌细胞生长速度为0.1～0.3 mm/d，而尿路上皮为0.1～0.2 mm/d。将上述细胞混合培养，干细胞的生长速度提高至0.5～1.0 mm/d。另外，干细胞单独培养时呈环状生长，而混合培养时呈线性生长，提示干细胞在与其他细胞联合培养时可能释放出一些趋化信号。Coppi等[24]的研究也获得了相似的结论，他们在冻伤膀胱的膀胱壁上注射入骨髓间质干细胞以观察其对膀胱的修复情况。细胞植入后30 d，仅有很少的干细胞转化为平滑肌细胞，大部分细胞失去了特异分化的能力，且彼此融合。但是，这些干细胞的存在阻止了一般膀胱损伤后会发生的平滑肌细胞肥大现象。

3 展望

目前的临床技术，对于膀胱的缺损修复以及功能重建尚有很大的不足。组织工程膀胱构建的可能性给临床患者带来了新的希望。随着组织工程膀胱构建研究的深入，各种原因导致的膀胱缺损，将会获得更好地修复。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）03－0171－03

2008年7月15日；

2008年8月31日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.016

200233上海市上海交通大学医学院附属第六人民医院泌尿外科。