组织工程半月板的研究进展

赵贵庆 崔磊 曹谊林

·综述·

组织工程半月板的研究进展

赵贵庆 崔磊 曹谊林

软骨是高等动物体内一种无血管的致密结缔组织，由位于软骨陷窝内的软骨细胞和细胞外基质构成。根据构成软骨的细胞外基质成分的不同，软骨分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。纤维软骨组织存在于椎间盘、耻骨联合、半月板、颞下颌关节关节盘以及肌腱与骨的附着部位等处。纤维软骨的细胞外基质中含有大量呈平行或交叉排列的由Ⅰ型胶原构成的胶原纤维束，软骨细胞单个、成对或成单行排列，分布于纤维束之间，基质中无定形成分。

半月板是膝关节内两块呈新月形的纤维软骨组织，对膝关节的正常功能有至关重要的作用，它能传导并分散应力至胫骨平台、吸收震荡、提高膝关节的稳定性、增加膝关节运动幅度并促进关节液循环[1]。半月板损伤是骨科的常见病，多由剧烈运动甚至不恰当的负重引起。半月板的外侧1/3有来自关节囊的血管滋养，发生在这一区域的损伤具有一定的自我修复能力；发生于内侧区的损伤由于没有血运，其自我修复能力差，损伤往往不能愈合，从而引起疼痛和功能障碍，影响患者的工作生活。远期的病理的改变主要是关节软骨的退行性改变，表现为骨关节炎的症状[2]。目前，越来越多的外科医生认识到半月板对于膝关节功能的重要性，针对的治疗措施是以尽可能地保留半月板为原则采用半月板修复术，无法修复的半月板常被部分或全部切除，这种措施虽然可以暂时缓解疼痛，但并不能逆转或阻止关节软骨退行性改变的发生。对半月板全切术后的患者采用同种异体半月板移植是一种可能的选择，对延缓关节软骨退行性改变的发生有一定的作用。但是，同种异体半月板移植供体有限，存在着疾病传播的可能，且半月板的形态个体之间存在差异，随访发现移植后的半月板有收缩的趋势[3]。

组织工程的发展为半月板缺损的治疗提供了新的思路，成为基础和临床研究的热点。基于组织工程原理的治疗措施包括：应用种子细胞促进半月板损伤的愈合；应用天然或人工合成的半月板假体替代切除的半月板组织；体外构建组织工程化半月板，然后植入体内，实现半月板的再生。本文就组织工程半月板研究的现状进行综述。

1 种子细胞

理想的组织工程半月板种子细胞，应来源于自体细胞，分布广泛、取材方便、对机体损伤小，体外增殖能力强并不易老化，且能产生大量的细胞外基质。

半月板纤维软骨细胞是最早被研究用来作为种子细胞的。Webber等[4]于1985年首次报道了半月板纤维软骨细胞体外培养和增殖的特性，并根据细胞的形态，提出半月板纤维软骨细胞是是由两类性质不同的细胞构成。半月板纤维软骨细胞在体外无支架、高密度培养条件下，并不像透明软骨细胞那样可以形成软骨组织，形成的组织类似于半月板的纤维结缔组织部分，仅有少量的蛋白多糖和Ⅰ型胶原的分泌[5-6]。纤维软骨细胞与Ⅰ型胶原支架材料复合在体外培养3周后，支架内部的细胞呈圆形或椭圆形，细胞周围有基质形成，但未见有软骨陷窝结构的形成[7]。但是将其接种在PGA支架或藻酸钙凝胶中，细胞材料复合物可以在裸鼠皮下形成纤维软骨样组织[8]。应用半月板纤维软骨细胞作为种子细胞接种支架材料修复半月板全缺损或部分缺损的实验显示，细胞材料复合物在体内3～6个月后能形成与正常半月板组织相似的纤维软骨组织，具有半月板的白区和红区的组织学特征[9-11]。研究所用的细胞都是从幼年动物的半月板中分离培养的，其增殖和产生细胞外基质的能力较强。大多数半月板损伤的病人是成年人，其半月板源性纤维软骨细胞的GAG和胶原合成能力以及体外增殖能力随着年龄增长而显著降低[12-14]。体外培养的半月板细胞随着扩增倍数的增加其成软骨的能力逐渐减弱，体外扩增3～4代后，细胞仅合成Ⅰ型胶原而不合成Ⅱ型胶原，表现为成纤维细胞的特性[12]。采用自体半月板细胞要求患者接受两次手术，第一次用开放手术或关节镜取出受损的半月板组织用于种子细胞的分离培养，经过一段时间的体外培养，形成可回植的组织工程半月板后，再次手术修复半月板的缺损，整个治疗周期较长，而且从患者的损伤半月板中分离的纤维软骨细胞数量有限，难以满足组织工程半月板构建对种子细胞量的需求[15]。应用同种异体半月板纤维软骨细胞修复兔半月板缺损的实验表明，在回植后6～10周后，植入物有少量的炎性细胞浸润，36周后形成类似半月板的纤维软骨组织，植入物周围没有明显的炎性肉芽组织形成[16]。该结果提示，半月板组织尤其是半月板的内侧无血管区可能具有免疫豁免的特性，同种异体的半月板细胞可以在此部位存活并发挥正常的生理功能。但是要获取人的同种异体半月板细胞还受到供体来源的限制。显然，半月板纤维软骨细胞并不是一种理想的组织工程半月板种子细胞。

关节软骨细胞是组织工程化软骨构建中研究得最多的种子细胞。关节软骨细胞在体外单层培养扩增期间，细胞逐渐表达Ⅰ型胶原，表达Ⅱ型胶原的能力下降，而这正是纤维软骨细胞区别于透明软骨细胞的特点之一。透明软骨细胞在体外三维培养条件下能产生6倍于纤维软骨的GAG，其胶原的合成能力也强于后者[17]。Peretti等[18]将猪的关节软骨细胞作为组织工程半月板的种子细胞，接种在灭活的同种异体半月板材料上修复自体半月板缺损，9周后实验组有愈合的表现，而对照组无一愈合。Weinand等[19]将猪的关节软骨细胞和耳软骨细胞体外分离扩增后，接种在Vicryl mesh支架上，植入自体或异体半月板无血管区的圆形缺损处（直径1 cm），12周后不论自体还是异体缺损都得到很好的修复。但是，关节软骨细胞在体外扩增后会去分化为仅分泌Ⅰ型胶原的细胞表型，GAG的合成能力也明显降低[20]；另外，关节软骨的获取需要损伤功能上更为重要的关节面，因此关节软骨细胞将不会被作为组织工程化纤维软骨的种子细胞而应用于临床。

干细胞具有旺盛的体外增殖能力和定向分化特性，因而成为了众多学者的研究方向。骨髓基质干细胞（BMSC）是一种成体干细胞，容易获得，可以体外扩增、定向（多向）诱导分化。TGF-β是诱导BMSC向软骨细胞分化的重要生长因子，单层培养条件下，2周后表达Ⅱ型胶原[21]。应用TGF-β诱导的BMSC可以修复猪关节非负重区的软骨缺损，表达软骨特异的细胞外基质成分[22]。从骨髓中分离的单核细胞注射于半月板裂伤部位，可以促进半月板损伤的愈合[23]。BMSC可以在半月板的无血管区存活，并产生细胞外基质[15]，在支架材料上体外三维培养较半月板纤维软骨细胞在相同条件下能产生更多的胶原和GAG[24]。Angele等[25]用兔的自体BMSC作为种子细胞，接种于透明质酸酯和凝胶构成的支架材料上，体外培养2周，回植入内侧半月板中份5 mm的缺损处，回植后12周，实验组明显优于单纯支架对照组，有纤维软骨样组织形成。徐青镭等[26-27]应用兔的BMSC作为种子细胞，在体外扩增并用bFGF和TGF-β1诱导，然后接种于胶原-GAG支架上植入体内，术后3～6个月，形成纤维软骨样组织，有软骨陷窝形成，细胞外基质中有大量平行分布的胶原纤维束和酸性黏多糖。虽然BMSC有自发成骨的倾向，体内实验中发现有部分新生的纤维软骨内有肥大软骨细胞和骨形成[28]，但是应用适当的诱导方案，BMSC是较有临床可行性的组织工程纤维软骨种子细胞。

胚胎干细胞具有无限增殖能力和全能分化潜能。体外研究显示，胚胎干细胞在一定的诱导条件下，可以表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和GAG，表现出向纤维软骨分化的特性[29]。但由于受到医学伦理等的制约，目前尚缺乏进一步的研究。

成纤维细胞是源于中胚层的一种间质细胞，其广泛存在于机体的各种组织中，被认为是具有组织特异性的背景细胞[30]。真皮成纤维细胞是皮肤中含量最为丰富的一种细胞，它表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ型胶原和透明质酸、弹性蛋白、多能蛋白聚糖（Versican）、核心蛋白多糖（Decorin）以及层黏连蛋白等[31]。

真皮成纤维细胞在一定的培养条件和诱导因子作用下可以向骨[32]、软骨[33-43]、成肌纤维细胞[44-45]、角膜基质细胞[46]分化，表现出多潜能分化的特性。成体皮肤成纤维细胞经过胰岛素预处理后，接种在有聚集蛋白多糖涂层的培养皿上，能表达更多Ⅱ型胶原和Aggrecan[34]。人皮肤成纤维细胞在含有脱钙骨粉的胶原三维支架中培养，具有向软骨分化的趋向[35-36，41-42]。低氧环境有助于成纤维细胞分泌软骨特异的细胞外基质[40]。在低氧条件下当培养液中含有40 mM的乳酸时可以诱导其表达软骨特异的细胞外基质[43]。低氧和蛋白激酶C阻滞剂联合作用，可以使成纤维细胞分泌软骨细胞表型的基质[47]。应用SOX5、SOX6、SOX9联合转染人皮肤成纤维细胞3 d内即有Ⅱ型胶原和Aggrecan表达[37]。人的真皮成纤维细胞与猪的软骨细胞在三维条件下共培养，形成软骨样组织，一部分真皮成纤维细胞转分化为软骨细胞[48]。本实验室早期的研究发现，人的皮肤成纤维细胞在软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)的作用下能分泌软骨特异的细胞外基质（Ⅱ型胶原和Aggrecan）；在高密度无支架三维培养条件下，软骨细胞的表型可以长期维持[33]。皮肤成纤维细胞取材简便、继发损伤小、体外增殖合成能力旺盛、经多次传代仍保持较好的增殖能力，是一种较理想的构建组织工程半月板的种子细胞。

2 支架材料

理想的半月板支架材料应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，而且应当有提供细胞黏附生长和产生细胞外基质的空间结构，营养物质在支架中的扩散效率能提供相对稳定的适宜的细胞代谢所需的化学环境，能结合细胞生长所需的刺激性或抑制性细胞因子。另外，支架材料要具有一定的机械强度，能适应关节内的力学条件而保持结构的完整性[3]。

基于上述因素的考虑，已有多种生物材料被用于组织工程半月板的构建研究。其中，天然生物材料包括纤维凝块、骨膜、软骨膜、肌腱、小肠黏膜下层、胶原制品以及灭活的同种异体半月板组织。纤维凝块是最早应用于半月板的生物材料，Arnoczky等[49]于1986年应用外源性的Fibrin blot修复狗的半月板撕裂模型。1990年，Henning等[50]将该技术用于临床，在术中获取患者的自体血，体外形成凝块后，注射在半月板撕裂处以促进损伤的愈合。进一步的研究表明，半月板细胞可以向纤维凝块内迁移，并合成细胞外基质[15]，半月板纤维软骨细胞与纤维凝块混合可以在体内促进半月板损伤的愈合[51]。骨髓基质干细胞也可以在纤维凝块内存活并增殖，体内实验显示能促进新生半月板样组织的形成[52]。骨膜组织植入半月板缺损区后不能形成纤维软骨组织，而是形成一个覆盖着透明软骨组织的楔形骨组织[28]。这显然与骨膜中含有的大量成骨细胞有关，在关节内环境中表现为软骨内成骨的过程。而自体肋软骨膜植入半月板全缺损模型后，可以形成纤维软骨样组织，组织学形态与正常半月板极为相似[53]。脂肪细胞[54]、肌腱细胞[55]在关节内也会形成纤维软骨样组织，而且对关节软骨有一定的保护作用。但是这些组织的力学强度有限，植入早期不能承载膝关节内的压力强度，往往导致半月板的内侧缘不能形成，对关节软骨的保护作用有限，以致远期都会产生骨关节炎的症状。

来源于天然胶原的生物材料具有良好的组织相容性、低抗原性、生物可降解性[7]，在制药和生物材料领域得到了深入研究和广泛应用，并已有多种胶原产品得到批准而用于临床。胶原半月板支架材料也是研究最为成熟的半月板替代物。未交联的胶原支架材料较化学交联后的支架材料具有更好的生物相容性[56]，植入半月板缺损部位后可吸引关节内的细胞浸润生长，最终可以形成纤维软骨组织[57]。由Ⅰ型胶原、硫酸软骨素和透明质酸复合生产的胶原半月板植入物（CMI）,已应用于临床。CMI表现出良好的治疗效果，形成了纤维软骨组织[58]，明显改善了患者膝关节的症状，延缓了关节软骨的退行性改变。将CMI接种上羊的自体半月板细胞修复半月板全缺损模型，结果显示实验组新生半月板在血管化、塑形、基质含量等方面优于未接种细胞的对照组[10]。徐青镭等[27]应用胶原-糖氨聚糖支架负载骨髓基质干细胞修复自体半月板缺损，形成了半月板样纤维软骨组织。

除了天然生物材料之外，许多学者对人工合成的高分子聚合物生物材料作为组织工程化纤维软骨的支架材料也进行了深入的研究，其中研究最多的是聚羟基乙酸（PGA）和聚乳酸(PLA)。PGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解产物羟乙酸对细胞无毒性作用，可最终代谢为CO2和H2O。PGA纤维可以通过PLA的有机溶剂塑形，提高支架材料的力学性能[16]。PGA的孔隙率较大，而且降解速度可以人为控制，是研究纤维软骨细胞在三维条件下的生物学行为的良好的载体[59-60]。以PGA-PLGA构建的支架材料负载同种异体纤维软骨细胞实现了兔全半月板的构建，支架材料完成降解[16]。其他用于组织工程纤维软骨的高分子生物材料还有聚酯和高分子水凝胶。为了提高材料的生物活性和力学性能，越来越多的研究关注于天然材料与人工合成材料复合生物材料的研究。天然材料具有良好的生物相容性，但是力学强度不能达到生理半月板的功能要求，而人工合成的材料往往具有良好的机械性能，但其生物活性不高，复合材料就是利用两者的优点，形成既具有一定力学强度又有良好生物活生的支架材料，如Ⅰ型胶原涂层的聚酯类生物材料[61]、含有透明质酸和聚己酸内酯的支架材料[62]等。

3 生长因子

生长因子是指能促进细胞增殖、分化、成熟的细胞因子。目前，用于组织工程纤维软骨的生长因子已经有很多种。转移生长因子-β1（TGF-β1）是研究最多的生长因子，它可以促进体外单层培养[63]和三维培养[60，64]的半月板纤维软骨细胞分泌胶原和GAG，维持纤维软骨细胞的表型。其作用强于胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）、PDGF-AB血小板源性生长因子-AB（PDGF-AB）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。TGF-β针对PGA支架材料上三维培养的羊半月板纤维软骨细胞，主要是促进其Ⅰ型胶原的合成，对Ⅱ型胶原的合成没有促进作用[64]；而对藻酸盐凝胶中三维培养的人半月板纤维软骨细胞有明显的促进其Ⅱ型胶原合成的作用[65]。这种差别可能是由于藻酸盐凝胶培养条件更接近于纤维软骨细胞的生理环境，有助于细胞表型的维持。TGF-β是通过抑制结缔组织生长因子（CTGF）的表达来发挥其生物效应的。CTGF是胚胎时期诱导组织形成的重要生长因子，能促进成纤维细胞的增殖。TGF-β通过抑制细胞的增殖，促进细胞分化和合成功能，分泌和沉积细胞外基质[66]。TGF-β与其他生长因子联合应用可以使多潜能细胞向软骨细胞分化，表达软骨特异的细胞外基质成分。TGF-β与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[26]、胰岛素样生长子-1(IGF-1)[67]能产生协同作用，以诱导间充质来源的细胞向软骨细胞表型分化。

软骨源性形态发生蛋白（CDMPs）是骨形态发生蛋白（BMP）家族中的新亚型，也是TGF-β亚群中的一个成员。CDMP-1是四肢骨发育，尤其是早期软骨发育的重要调节因子，能促进间质细胞的聚集和向软骨分化。该基因的缺陷可以引起四肢骨，尤其是肢端的发育障碍[68]。CDMP-1能诱导体外培养的韧带成纤维细胞和皮肤成纤维细胞向软骨细胞表型分化[69，33]。CDMP-1转染的骨髓间质干细胞可以促进关节软骨缺损的愈合[70]。TGF-β与CDMP-1联合，可以诱导人胚胎来源的骨髓基质干细胞表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和GAG，使之分化为纤维软骨细胞[71]。这表明，CDMP-1是间充质来源细胞向软骨细胞分化的重要生长因子。

表皮生长因子（EGF）是从来自鼠颌下腺的神经生长因子中发现的。在离体培养实验中，EGF对成纤维细胞和内皮细胞具有促有丝分裂作用。它与TGF-β具有相同的受体,两者协同可以促进细胞的增殖，有助于组织工程半月板的血管化。腺病毒载体编码的肝细胞生长因子（HGF）转染半月板细胞可促进细胞材料复合物血管化[72]。HGF与PDGF联合应用，可以趋化半月板细胞向损伤部位迁移并产生细胞外基质[73]。

在成体干细胞或分化细胞向软骨细胞分化的过程中，外源性细胞因子的加入发挥着不可或缺的作用[28]。选择适当的细胞因子在组织工程半月板的构建过程中具有重要的意义。

4 力学因素

半月板在膝关节内起着应力传导、稳定和润滑关节的作用。半月板的外侧红区组织学上与肌腱相似，是由Ⅰ型胶原构成的致密结缔组织构成，主要承受拉力负荷；内侧白区则与透明软骨和肌腱的腱帽相似，主要承受压力负荷[1]。应力刺激是半月板发育过程中必不可少的条件之一。鸡胚中虽然可以看到发育的半月板，但是半月板是卷曲退化的，即使是完全发育的半月板，经过一段时间的固定后也表现出退化的倾向[1]。对离体半月板机械刺激显示，静态压力能抑制胶原和糖蛋白前体的摄取，而动态变化的压力则具有较高的蛋白多糖的表达。应用生物反应器对细胞悬液中的胶原材料施加压力负荷，结果实验组细胞的浸润和组织的再生均不如对照组[56]。对骨髓基质细胞与支架材料复合物施加周期性的动态压力刺激可以上调胶原和蛋白多糖的表达水平，促进细胞外基质的分泌[74]。组织工程半月板应用于临床必须达到3个力学要求：①新生的半月板组织达到生理半月板的力学强度；②新生半月板的几何形状与受体的关节相适应；③新生半月板回植后能与胫骨平台很好的连接[75]。力学刺激对于提高组织工程化半月板的机械强度有着不可代替的作用[76]。由于生物反应器的研究滞后，对于如何施加力学刺激、何时施加，以及力的强度等，都还有待进一步的研究。

5 展望

组织工程研究要从实验室研究走向临床应用还面临着巨大的挑战。第一，如何有效地对人体组织进行成规模的体外培养；第二，如何构建能满足体内力学要求的成熟的功能化组织工程组织[76]；第三，如何将构建的组织工程化组织植入体内，发挥其生理功能。组织工程半月板也面临着同样的问题。选择合适的种子细胞，并体外构建成熟的组织工程半月板将是以后研究的重点。

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Q813.1+2

B

1673－0364（2009）03－0166－05

2008年10月25日；

2009年2月3日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.015

410000湖南省长沙市亚韩医学美容医院（赵贵庆）；200235上海市上海组织工程研究与开发中心（崔磊，曹谊林）。