趋化因子配体16对人胰腺癌细胞株PANC1生物学行为的影响

杜杰 江涛 王西墨 张姝翌

·论著·

趋化因子配体16对人胰腺癌细胞株PANC1生物学行为的影响

杜杰 江涛 王西墨 张姝翌

目的探讨趋化因子配体16(CXCL16)对人胰腺癌细胞PANC1生物学行为的影响。方法取对数生长期的人胰腺癌细胞PANC1，分别加入50、100、200 ng/ml的重组人CXCL16(rhCXCL16)和抗CXCL16抗体处理4 h，以不加rhCLCL16作为对照。采用MTT法检测细胞增殖，采用Mqrtigel基质检测细胞的黏附率，采用Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力。结果100 ng/ml rhCXCL16处理PANC1细胞后，细胞增殖、对基质的黏附率、侵袭和迁移能力分别为0.264±0.021、(91.4±8.6)%、1.246±0.216、1.361±0.276，其中细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力均显著高于对照组的(20.6±3.2)%、0.259±0.013、0.199±0.008(Plt;0.01)，对细胞的增殖不影响；200 ng/ml rhCXCL16处理后，细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力进一步提高到(92.1±6.3)%、1.511±0.174、1.600±0.208(Plt;0.05)。结论CXCL16可诱导人胰腺癌细胞PANC1增强对基质的黏附性、侵袭性和迁移性。

胰腺肿瘤； 趋化因子类； 细胞增殖； 细胞黏附； 细胞侵袭； 细胞迁移

中国已成为肿瘤致死原因的第4位[1]。胰腺癌治疗效果不佳的主要原因之一是癌细胞高度恶性的生物学行为，因此对其生物学行为影响因素的深入了解有利于胰腺癌的综合治疗。CXCL16是2000年底新发现的肿瘤微环境中重要的趋化因子类炎性介质。本实验观察不同浓度的CXCL16对人胰腺癌细胞株PANC1生物学行为的影响。

材料与方法

一、细胞培养及分组

人胰腺癌细胞株PANC1购自南京凯基生物技术公司，在37℃、90%湿度、5% CO2条件下，置10% FBS DMEM培养基中进行培养传代。收集细胞，调整浓度为105/ml。将100 μl PANC1细胞接种于24孔板中，每孔加入100 μl重组人CXCL16(rhCXCL16)，浓度分别为50、100、200 ng/ml以及200 ng/ml+CXCL16中和性抗体1 μg/ml，以不加rhCXCL16作为对照组。每种浓度设5个复孔。

二、细胞增殖检测

采用MTT法。各组细胞培养24 h后每孔加入MTT 20 μl，37℃继续孵育4 h，弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，取100 μl加入96孔板，用酶标仪测各孔A490值。

三、细胞黏附率检测

采用Martigel基质黏附法。以每孔50 μl Martigel包被基底膜，加入上述各组细胞37℃孵育4 h，PBS清洗未黏附的细胞2次，加入无血清DMEM 100 μl及MTT 20 μl，37℃继续孵育4 h;弃上清，加入150 μl DMSO，轻轻振荡10 min，上酶标仪测各孔A490值。以37℃孵育4 h后，每孔直接添加20 μl MTT溶液的各组细胞作为对照。细胞黏附率=(实验组A490值/对照组A490值)%。

四、细胞侵袭力检测

采用Transwell小室检测[2]。Transwell细胞侵袭小室购自美国Corning公司。用预冷无血清培养基1∶5稀释Matrigel胶后包被基底膜，下室加入5%FBS培养基0.8 ml ，再依次加入不同浓度的rhCXCL16各100 μl，上室加入0.2 ml浓度为5×105/m1的细胞悬液，每组5个复孔。CO2培养箱孵育48 h后，采用MTT法测下室细胞A490值。

五、细胞迁移能力检测

除Transwell上室中不加入Matrigel外，其余操作同细胞体外侵袭实验，以下室细胞的A490值表示肿瘤细胞的迁移能力。

六、统计分析

结 果

一、细胞增殖的变化

对照组、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXLL16+CXCL16抗体组细胞的A490值分别为0.231±0.020、0.252±0.011、0.264±0.021、0.286±0.011和0.242±0.010，各组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

二、细胞黏附率的变化

对照组、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXCL16+CXCL16抗体组细胞的黏附率分别为(20.6±3.2)%、(67.9±5.7)%、(91.4±8.6)%、(92.1±6.3)%和(25.1±3.7)%。随着rhCXCL16浓度的增加，PANC1细胞的黏附率显著性增高(Plt;0.01)，但加抗体组与对照组相比，差异无统计学意义。

三、细胞侵袭和迁移能力的变化

对照组、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXCL16+CXCL16抗体组的细胞侵袭能力分别为0.259±0.013、0.347±0.091、1.246±0.216、1.511±0.174和0.261±0.038；迁移能力分别为0.199±0.008、0.408±0.103、1.361±0.276、1.600±0.208和0.312±0.066。随着CXCL16浓度的增加，PANC1细胞的侵袭和迁移能力均增高，其中100、200 ng/ml组与对照组比较差异有统计学意义(Plt;0.01)，其余各组间比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

讨 论

近年来，肿瘤细胞生物学行为的恶性度研究已成为热点。国外实验研究表明，CXCL16在前列腺癌、结直肠癌和胰腺癌组织中显著性高表达，且rhCXCL16能诱导前列腺癌细胞株PC3、LNCaP细胞的侵袭和迁移能力[3-5]。本实验结果显示，随着rhCXCL16浓度的增加，各组细胞的增殖能力无显著差异，说明rhCXCL16对胰腺癌细胞生长的影响不大，这与Wente等[6]报道的rhCXCL16对胰腺癌细胞株BxPC3、CAPAN-1细胞增殖能力无明显影响相一致。分析原因可能是rhCXCL16并不是通过提高癌细胞数量来增强其转移能力。但随着rhCXCL16浓度的增加，各组细胞对基质的黏附率、侵袭和迁移能力均呈剂量依赖性增加，提示其通过影响细胞上述三种生物学行为来促进癌细胞远处转移。细胞对基质黏附率的增加可能是rhCXCL16使由黏附分子介导的肿瘤细胞彼此之间的黏附力减少，然后诱导癌细胞表面生成只在正常细胞基底面表达的层粘连蛋白(LN)的高亲和力受体，后者能与基底膜的LN分子定向附着。侵袭和迁移能力增加的原因可能是：(1)影响肌动蛋白的活性。以肌动蛋白为基础的运动系统是细胞对外界刺激产生反应的重要动力结构，为目前公认的肿瘤运动和转移相关骨架蛋白。Youngs等[7]报道，乳腺癌细胞受趋化因子刺激后，细胞内肌动蛋白水平升高并发生聚合，细胞骨架蛋白重排，癌细胞朝趋化因子浓度梯度方向移动，并呈剂量、时间依赖性。(2)增强整合素的表达。整合素家族是一类重要的细胞黏附分子。黄涛等[8]报道，胰腺癌组织整合素β1表达显著性增高，并与肿瘤淋巴结转移、TNM分期和分化程度均相关，并证明其与胰腺癌细胞的增殖、分化、黏附、迁移、侵袭和转移密切相关。(3)E-钙粘蛋白表达降低。钙粘蛋白是一类重要的细胞黏附因子，介导同种细胞间相互黏附，参与形成和维护正常细胞间的连接，其中E-钙粘蛋白与肿瘤的浸润转移关系最为密切，其胞外结构域与对侧细胞上E-钙粘蛋白的对称部位连接，促进细胞间的黏附。大量的实验和临床研究表明[9]，E-钙粘蛋白具有抑制肿瘤细胞浸润的作用，高侵袭肿瘤细胞与基底膜黏附能力升高同肿瘤细胞间同质性黏附能力下降呈正相关，其表达缺失与肿瘤细胞的低分化和高侵袭力密切相关。(4)增加基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌。Mckenna等[10]报道，有淋巴结转移的胰头癌组织中MMP-2的表达较无淋巴结转移的癌组织显著性提高。Lu等[3]也报道rhCXCL16通过增加明胶酶的分泌增强对前列腺癌细胞株侵袭性的诱导。

本实验研究表明，rhCXCL16通过诱导人胰腺癌细胞株PANC1细胞对基质黏附性、侵袭和迁移能力来增强癌细胞远处转移的能力，为胰腺癌浸润发展、基础研究提供了新的思路，同时也为临床胰腺癌的分子靶向治疗提供了实验依据。

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2009-03-09)

(本文编辑：吕芳萍)

EffectofCXCL16onthebiologicalbehaviorofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

DUJie,JIANGTao,WANGXi-mo,ZHANGShu-yi.

DepartmentofGeneralSurgery,TianjinPeople'sHospital,Tianjin300121,China

DUJie,Email:huoliw@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of CXCL16 on the biological behavior of human pancreatic cancer cells PANC1.MethodsExponentially growing PANC1 cells was exposed to different concentration of rhCXCL16 (50,100,200 mg/ml) and CXCL16 antibody for 4 h, and PANC1 without rhCLCL16 treatment was used as the control. The proliferation was determined by MTT method, adhesion rate was determined by Mqrtigel matrix, invasion and migration of PANC1 cells were assayed by Transwell chamber.ResultsAfter 100 ng/ml rhCXCL16 treatment, proliferation, adhesion rate, invasion and migration of PANC1 cells were 0.264±0.021, 991.4±8.6)%,1.246±0.216, 1.361±0.276, respectively; and the adhesion rate, invasion and migration were significantly higher than (20.6±3.2)%, 0.259±0.013, 0.199±0.008 in the control group (Plt;0.01),and without significant effect on proliferation. After 200 ng/ml rhCXCL16 treatment, proliferation, adhesion rate, invasion and migration of PANC1 cells were further improved.ConclusionsrhCXCL16 could enhance the ability of adhesion, invasion and migration of PANC1 cells.

Pancreatic neoplasms; Chemotactic factors; Cell proliferation; Cell adhesion; Cell invasion; Cell migration

胰腺癌是一种病情凶险、治愈率低、预后极差的消化道恶性肿瘤，其发病率在全世界呈上升趋势，在

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.015

300121 天津，天津市人民医院普外科(杜杰、江涛、王西墨)、消化科(张姝翌)

杜杰，Email:huoliw@126.com