有氧运动抗ＡｐｏＥ－／－小鼠动脉粥样硬化的Ｌ－精氨酸机制探讨

张　靓　黄叔怀　曾柏生

摘要：目的：以ApoE基因缺陷小鼠为动脉粥样硬化模型，观察有氧运动对小鼠动脉粥样硬化斑块的作用，及运动对血浆一氧化氮（nitric oxide，NO）、血浆L-精氨酸（L-arginine, L-Arg）与不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethlarginine，ADMA）比值的影响，以探讨NO及其底物L-Arg在运动抗动脉粥样硬化中的作用。方法：ApoE基因缺陷小鼠随机分为安静对照组和运动组（游泳运动，2 h/次，5次/周，共10周），分别测定粥样斑块面积，采用硝酸还原酶法测定血浆中NO水平，利用高效液相法测定血清中ADMA与L-Arg的水平，另对血清肌酐和肾脏超微结构进行观察。结果：与对照组相比，运动组小鼠斑块面积显著减小40%（P<0.01），小鼠血浆NO水平升高15倍（P<0.01），L-Arg/ADMA比值显著升高10%（P<0.05）。结论：有氧运动使血浆L-Arg/ADMA比值升高，促进L-Arg的利用，NO合成增多，可能是运动抗动脉粥样硬化的机制之一。

关键词：有氧运动；动脉粥样硬化；ADMA；L-Arg

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)03-0336-03

大量流行病学资料表明，有氧运动是防治动脉粥样硬化及其并发症的有效措施。运动可通过调节脂代谢、提高机体抗氧化能力等机制减轻动脉粥样硬化损伤。自1987年气体小分子一氧化氮（nitric oxide, NO）被发现后，立即成为动脉粥样硬化发病机制研究的新靶点。大量研究表明一氧化氮除了促进血管舒张之外，还具有抗氧化、阻止血小板聚集和单核细胞粘附、抑制平滑肌细胞增值等多种作用，是一种公认的抗动脉粥样硬化因子，动脉粥样硬化时NO系统功能紊乱已成为动脉硬化的发病机制之一。

L－精氨酸（L-Arginine，L-Arg）是合成NO的底物，在一氧化氮合酶的作用下，生成一氧化氮和L－瓜氨酸。当机体L-精氨酸利用遇到障碍时，一氧化氮合成减少，是动脉粥样硬化时NO系统功能紊乱的重要原因。近期研究表明动脉粥样硬化时存在L-Arg的相对不足，即L-Arg的含量并没有显著性变化，但L-Arg的利用确显著降低。目前研究提示L-Arg进入细胞被进一步利用是通过L-Arg转运体来实现的，其转运速率并不仅依赖于L-Arg的浓度，还受多种因素调节，如切应力等。此外L-Arg与一氧化氮合酶的亲和力的变化也是影响L-Arg利用的原因。近年来一氧化氮合酶内源性抑制剂的发现为L-Arg利用障碍的研究提供了新的途径。

内源性一氧化氮合酶抑制剂为L-精氨酸的同系物，包括单甲基精氨酸（L-NMMA）和二甲基精氨酸（包括ADMA和SDMA，SDMA不具有活性），其中研究较多的是不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethlarginine，ADMA），其与L-精氨酸竞争性的抑制一氧化氮合酶活性，减少NO的生成，现认为ADMA升高是动脉硬化新的危险因子。

本工作以ApoE基因缺陷小鼠为动脉粥样硬化模型，观察有氧运动对小鼠动脉粥样硬化斑块的作用，及运动对血浆NO、血浆L-Arg与ADMA比值的影响，以探讨NO及其底物L-Arg在运动抗动脉粥样硬化中的作用。

1材料和方法

1.1材料8周龄ApoE基因缺陷小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，恒定室温下饲养，每12 h昼夜交替光照，饲以“西方膳食”饲料（胆固醇0.15%，脂肪21%），自由饮水。一氧化氮测定试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供，ADMA及L-Arg标准品均购自Sigma公司。其余为市售分析纯产品。

1.2运动模型的制备及分组取相同8周龄大鼠实验共有两组（n＝6）：1) ApoE基因缺陷对照组：不运动的ApoE基因缺陷小鼠；2) ApoE基因缺陷运动训练组：进行无负重游泳运动，游泳槽深60 cm，水温保持在(31±1)℃。游泳运动共持续11周，每周5次，每次120 min，每次游泳都在同一时间进行（15:00-17:00），有氧运动时间参照李晖等报道。游泳训练的第一周为适应性训练，由最初的15 min直至120 min，每天递加。全部动物于ApoE基因缺陷末次运动后24 h，摘眼球取血；取左侧肾脏，预固定；迅速打开胸腔，连同心脏及主动脉取出，固定于蜡块平皿，解剖镜下去除结缔组织，液氮保存，用于下述测定。

1.3油红O染色测定斑块面积根据Paigen B等方法进行。以两心房尖为点所连成的直线部位，去除以下心室，然后装台，OCT包埋后，进行冰冻切片。切片厚度为8 μm，从主动脉瓣即将消失的部位开始向升主动脉方向取片，每隔一张取片，所取得的切片，进行油红O染色及HE复染后，每隔5张取一张参与评估，共取5张，利用计算机模拟图象分析（CMIAS-998型图象分析系统）对油红O染色部位进行面积估算。

1.4高效液相法测定血浆L-Arg和ADMA水平根据文献介绍的方法［1］，处理样品。按1 mL血清加入20 mg 5－磺基水杨酸（salicylsulfonic acid，SSA）的比例在样品中加入5－SSA沉淀蛋白，冰浴反应10 min，离心（2 000 g,10 min），吸取上清液，经0.45 μm 的滤膜过滤后待测。L－Arg和ADMA标准品用50％甲醇配成100 mg/mL左右浓度的储备液，－20℃储存。临用前用人工脑脊液（NaCl 7.605 g,KCl 0.223 g,NaH₂PO4·2H₂O 0.072 g, NaHPO4·12H₂O 0.014 g, NaHCO₃ 2.1 g,MgCl2·6H₂O 0.162 g, CaCl2 0.144 g,溶解后定容至1 000 mL，pH 7.4）稀释后测定，稀释倍数分别为80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。将27 mg邻苯二甲醛（OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入2－巯基乙醇（2－MCE）20 μL,加入0.1 mmol/L四硼酸钠缓冲液（pH 9.5）至5 mL制得衍生液，避光室温保存。上样前将20 μL标准液或样品液与10 μL衍生液混匀，精确反应90 s，进样20 μL。流动相包括四种，各自成分如下：流动相A：100％甲醇，流动相B：纯水，流动相C：25％甲醇，3％四氢呋喃，72% 0.05M PBS，流动相D：70％甲醇，3％四氢呋喃，27% 0.05M PBS，流动相均经0.45 μm滤膜过滤，超声波脱气后使用。采用Waters HPLC系统，分析柱为Inertsil ODS-2，流速为1 mL/min，温度为30℃，荧光检测调节为激发光338 nm、发射光425 nm。

根据标准品作出标准曲线，计算出函数，将所测样品的峰面积分别代入函数，计算L-Arg及ADMA水平。

1.5透射电镜观察肾脏超微结构肾脏组织经1％锇酸固定，磷酸缓冲液冲洗，分别以50％、70％、90％、100％乙醇依次脱水，环氧树脂包埋。光镜下修块、定位，然后制超薄切片，片厚50 nm，用醋酸双氧铀染核结构，柠檬酸铅染膜结构，于透射电子显微镜下观察肾小球结构。

1.6其他测定血浆NO水平采用硝酸还原酶发测定，血浆肌酐水平采用苦味酸法测定。

1.7统计学分析实验结果以均数±标准差（X±s）表示。组间比较采用Student-Newman-Keuls检验，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1有氧运动对小鼠动脉粥样硬化损伤的影响与安静对照组相比，运动组小鼠主动脉粥样斑块面积缩小40%（1 835．0±401.46 vs 1 131.8±240.06，P<0.01）(图1)。

图1ApoE基因缺陷小鼠主动脉冠状面油红O染色观察。

A为安静组，B为运动组（10×）2.2有氧运动对小鼠血浆L-Arg/ADMA比值、NO水平的影响与对照组相比，运动组血浆NO水平显著升高15倍（P<0.01），血浆L-Arg水平无显著变化，但血浆ADMA水平显著降低8%（P<0.05），因而血浆L-Arg/ADMA比值升高10%（P<0.05）（表1）。血浆NO水平与L-Arg/ADMA比值呈显著正相关（r＝0.867，P<0.05）。

2.3有氧运动对小鼠肾脏超微结构的影响与对照组相比，运动组血浆肌酐水平无显著变化〔（43.863±4.879)μmol/L vs(43.067±5.381)μmol/L，P>0.05）〕。对两组肾小球滤过膜的结构观察发现，肾小球滤过膜均匀、完整、无增厚；内皮细胞扁平，胞核清晰，内皮孔明显，分布均匀；基膜均匀无增厚；足细胞正常大小，足突无肿大，均匀排布于基膜外侧。两组透射电镜观察结果一致，无差别（图2）。

3讨论

L－Arg是一氧化氮合酶的底物，在酶的作用下，生成一氧化氮和L－瓜氨酸，当L-Arg缺乏时，NO的合成减少。对血浆中L-Arg水平测定发现，与正常动物相比，动脉硬化模型动物血浆中的L-Arg浓度没有显著的改变。但给予动脉粥样硬化或高脂血症的动物饮食补充L－Arg，却能够阻止病变发展。有研究报道［2］，补充L-Arg显著减小低密度脂蛋白受体敲除小鼠的动脉粥样硬化损伤面积，并完全阻断斑块的发展。L-Arg补充改善了胆固醇喂养的兔动脉硬化模型NO依赖性血管舒张［3］，抑制血管壁细胞增生，抑制血管单核细胞的聚集［4］，使内膜增生显著减少，改善动脉硬化［5］。血浆L－Arg水平与L-Arg利用之间存在的矛盾现象提示，动脉硬化时，L－Arg利用存在障碍。

国内学者采用Pic-TagTM氨基酸分析法［6］发现给家兔饲以高胆固醇饲料三个月，可使家兔主动脉壁L-Arg水平显著降低。血浆中的L－Arg进入细胞被利用，是通过L-Arg转运体来实现的。转运多具有饱和性，在内皮细胞中，转运速率并不仅依赖于细胞内L-Arg浓度，还有多种调节因子，其中剪切力是一个重要因素。此外，动脉粥样硬化时，NOS与L-Arg的亲合力下降［7］，也是导致L-Arg利用障碍之一。近期，一氧化氮合酶内源性抑制剂（ADMA）的研究为体内LArg的利用障碍提供了新的解释。

ADMA是L－Arg的同系物，可竞争性的抑制一氧化氮合酶的活性，使体内NO的合成减少，在多种心血管疾病中均存在血浆ADMA的水平升高的现象。ADMA能直接作用血管，引起血管收缩，导致内皮功能紊乱［8，9］；另有实验发现，在离体培养的内皮细胞孵育液中，加入一定量的ADMA后，单核细胞趋附蛋白－1表达增加，促进细胞黏附［10］。在对高胆固醇血症患者注射L-Arg后，血浆L-Arg水平升高，ADMA无显著变化，L-Arg/ADMA比值升高，部分恢复了NO的活性及内皮功能［11］。血浆L-Arg/ADMA比值是间接反映NO合成情况的一个指标。运动对血浆ADMA水平的影响目前尚不清楚。

本工作以ApoE基因缺陷小鼠为动脉粥样硬化模型，饲以“西方膳食”，19周后均于主动脉弓处出现显著的动脉硬化斑块损伤。10周的有氧运动显著减小了主动脉粥样硬化斑块面积，抑制了动脉粥样硬化的发展。有氧运动显著升高血浆NO水平，提示有氧运动促进了动脉硬化小鼠NO的合成。此外有氧运动抑制了ADMA的合成，显著升高血浆L-Arg/ADMA比值，并与血浆NO水平呈显著正相关，表明运动通过抑制ADMA的合成，促进L-Arg的利用，改善了动脉粥样硬化时NO系统的功能，从而发挥其抗动脉粥样硬化的作用。

影响体内ADMA水平的可能原因大致有以下四个方面：首先是二甲基精氨酸二甲氨水解酶（DDAH），其降解ADMA，生成二甲胺和L-瓜氨酸，广泛存在于人血管内皮细胞和肝、肾、脑等组织细胞内，其活性影响ADMA的水平［12］；其次甲基转移酶，蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）在人类已分离出四种亚型，其催化蛋白精氨酸甲基化，甲基化的蛋白质水解后，释放出游离的ADMA；甲基转移酶活性的变化也是致使内源性NOS抑制剂水平升高的机制之一［13］。第三，脂质过氧化诱导内源性NOS抑制物水平升高，抗氧化剂维生素E使ADMA水平下降［14］，同时，Ach诱导的离体胸主动脉内皮依赖的血管舒张改善；最后，肾功能的状况，体内ADMA的代谢有部分是通过尿液排出体外，当肾功能下降时，排泄障碍，从而使血浆中ADMA积聚，浓度升高。此时，血浆ADMA浓度与血浆肌酐浓度成正比。

在本实验中，为了探讨运动的影响ADMA合成的机制，对ApoE基因缺陷小鼠血浆肌酐及肾脏的超微结构进行了观察，实验结果表明，肌酐水平在两组之间无显著差异，电镜观察的结果同样表明，运动组和安静组肾脏超微结构均无任何病变迹象，表明本工作中ADMA水平的变化与肾功能无关。运动是通过何种机制影响ADMA的水平，还需进一步实验研究。

4结论

本工作发现，有氧运动通过抑制ADMA的合成，促进L-Arg的利用，改善了动脉粥样硬化时NO系统的功能，可能是其发挥其抗动脉粥样硬化作用的机制之一。

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