建兰花叶病毒厦门分离物的提纯及ＲＴ－ＰＣＲ检测

明艳林　郑国华

摘要以蔓陀罗为建兰花叶病毒(cyMV)厦门分离物的繁殖寄主。通过一次差迷离心、一次PEG沉淀结合超速离心提纯建兰花叶病毒，病毒得率约400 mg／kg。根据已经报道的建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物，分别以该病毒RNA及病叶总RNA为模板，建立了建兰花叶病毒RT-PCR快速检测体系，其检测灵敏度可达1．o Pg病毒和11mg／mL的病叶组织。

关键词植物病理学；建兰花叶病毒；RT-PCR；检测

中图分类号S 436．8

建兰花叶病毒属马铃薯X病毒属(Potxvirus)，线状，长约475nm，宽约12nm，病毒核酸为ssRNA。CyMV是迄今已报道从兰花上分离到的25种病毒中分布最广、危害最严重的种类之一，世界各兰花产区都有发生。我国海南和广东等地都已分离鉴定了CyMV分离物，并对该病毒的基因组及其检测方法进行了研究。美国、新加坡、韩国从本地栽培兰花中分离鉴定出CyMV，并就其病原学和分子生物学等方面进行了广泛的研究。研究表明，不同的CyMV分离物之间存在较大的株系差异。

近午来．厦门地区兰花种植区的蝴蝶兰上严重发生病毒病，田间病株叶片上有明显的花叶症状，严重时叶片发育受阻，呈畸形，花朵小且色泽不鲜，产量质量都受到影响。作者曾从感病蝴蝶兰病株中分离鉴定CyMV分离物，本文报道该病毒分离物的精提纯方法，并建立了建兰花叶病毒RT-PCR快速检测体系。

1材料

1．1毒源

毒源采自厦门兰花圃，经分离鉴定为CyMV。以蔓陀罗(DaturastFqlHOTIIUum)为繁殖寄主，摩擦接种CyMV，置隔离检疫温室内培育生长，5～7d后开始发病，采集病叶保存在-40℃冰箱内备用。

1．2试剂

Taq酶、AMV反转录酶、RNasin均购自Pro—mega公司；Trizol试剂购自广州华粤公司。

1．3引物

据已报道CYMV核酸序列进行同源性比较。设计一对引物．上游引物PL<48～169)为5-CCCGAAGAAATCAAGGCCATA3；下游引物P2(898～919)为5—AGCACGTTCACGGTCAGTAGG3．设计目的片段为750bp，上海生物工程公司合成。

2方法

2．1病毒提纯

参照Frowd等方法进行改动，具体步骤如／min下：将100g冰冻病叶加入0.5 mol／L。柠檬酸钠缓冲液100mI-在捣碎机中将病叶捣碎，过滤，用CCL，100ML乳化20 min，将滤液10 000 r／min离心20rain，上清液加入4％体积质量的PEG(MW6 000)和o．25％体积质量的NaCl搅拌溶解。4℃过夜；10000 r／min离心20min，沉淀用0．1 mol／L。硼酸钠缓冲液悬浮，充分匀浆后搅拌1 h，5 000 r／min离心20rllln，取上清，4()000 r／mln离心2 h，沉淀用o．1 mol／I硼酸缓冲液上清液匀浆悬浮，5 000r／thin离心15min，上清液即为粗提纯病毒制剂。将L：清液(粗提纯的病毒)在超速离心机上以25 000 r／Illln离心2，5 h，取出病毒带，在40 000r／mm离心2 h，沉淀用o．01 mol／I-硼酸钠缓冲液悬浮，得提纯CyMV。

2．2电镜观察

提纯的病毒用2％磷钨酸负染5 rflln．透射电镜观察。

2．3RNA提取

方法一：取200uL提纯的病毒制剂，加800uLTrizol，200。DEPC处理过的水，混匀，室温静置5 nun；加200 uL无RNA酶的氯仿，用力混匀，室温静置3rain；4℃，12 000r／mln离心15rmn；取上层液体，加入500。无RNA酶的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃12 000r／rnln离心15mtn；上清液，加入无菌的70％乙醇14 7 500r／mm，5mm，弃上清液，风干后即为RNA。方法二：提取组织(叶片)总RNA：先将组织加入液氮研成粉末，其余方法同方法一。以接种缓冲液的蔓陀罗为对照，并设空白对照。

2．4反转录

提纯病毒抽提的RNA用37ulDEPC处理过的水溶解。反转录体系为：RNA制剂37、dNTP1、RNasin 0．5。及反转录Bufferl070 1101llin，冰浴5 min，加入RNasin 0．5下游引物l+反转录酶0．5／JI+42‘C 1 h。

2．5PCR扩增

取反转录产物2PI。作为模板，引物P1、P2各o．2反应程序为：94℃预变性5 nun，94 C 40 h58℃复性35 h72℃延伸40x，循环次数为35次，72 C延伸12rain。反应结束后，取10 ILL扩增产物于1％琼脂糖凝胶上(含EBo．5√mL)进行电泳。

2．6RT-PCR检测灵敏度的测定与应用

对建立的建兰花叶花病毒RT-PCR检测体系进行灵敏度测定并应用该体系对厦门地区种植的大花蕙兰、蝴蝶兰、卡特兰和石斛兰进行测定。

3结果

3．1病毒提纯

通过使用不同方法对建兰花叶病毒进行提纯，发现多次使用差速离心，病毒断裂厉害；PEG沉淀次数过多，病毒得率很低。经改进，利用差速离心技术结合一次聚乙二醇(PEG6000)沉淀，再经一次蔗糖不连续密度梯度离心，提纯的病毒完整性和纯度均较好，得率约400mg／k80提纯的病毒经2％磷钨酸负染电镜透射，可以观察到大量K约475nm，宽约12niil的线状病毒，与已报道的一致，如图l所示。

3．2 RT-PCR扩增

对纯建兰花叶病毒RNA和病组织总RNA分别进行RT—PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，结果表明两者的扩增产物在泳道中均只有一条特异性染色带，大小约600 bP，与预汁的目的片断大小一致。

3．3检测灵敏度测定

将提纯的建兰花叶病毒RNA和感病兰花叫‘片组织液进行梯度稀释，然后测定RT-PCR对其检测灵敏度。结果表明可检出提纯的建兰花叶病毒RNA最低含量为1．8 pz，病叶组织11 mg／mL。

4讨论

近年来，随着兰花产业的发展，兰花的国际国内贸易和种质交换活动十分频繁，这是病毒病远距离传播的主要原因，而传统血清学检测方法一方而诊断符合率不高，另一方面难以达到早期诊断目的。因此建立灵敏、快速病毒病害检测方法对加强口岸检疫，从而防治建兰花叶病毒传人、传播意义重大。建兰花叶病毒的外壳蛋白基因是一个保守基阅。根据它的保守性，设汁引物，建立该病毒的检测技术，这无疑是早期准确诊断兰花是否感病的有力证据。本文建立的RTPCR快速检测体系灵敏度为纯病毒RNA 1．8 pz，病叶组织ll mg／mL，取样量少。应用本检测体系对厦门地区种植的大花蕙兰、蝴蝶兰、卡特兰和石斛兰病株，以及本室培养的蝴蝶兰组培苗进行测定，均能检测出cyMv，其症状主要表现为叶片褪绿条纹、褪绿斑块、致密黑斑和坏死斑。