百合黄瓜花叶病毒及其检测

刘文洪　洪　健　陈集双　叶美琴　黄东峰

摘要应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了浙江丽水和杭州的东方百合、亚洲百合等栽培品种上黄瓜花叶病毒(CMV)，64个田间样品中有26个带毒，检出率为40．6％~dsRNA检测结果与已知CMV—FQS株系的电泳条带相同，但百合组织中CMVdsRNA含量较低；电镜观察，受CMV侵染的样品中大多含有线状病毒，复合侵染率为35．9％；寄主反应测定显示从百合植株上获得的CMV株系均不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色蔡、普通烟、心叶烟等6科10种指示植物。

关键词植物病理学；黄瓜花叶病毒；百合；EIJSA；dsRNA检测

中图分类号S 436．8

百合是一种重要的经济作物，鳞茎宜粮宜菜，还可入药，花供观赏，在我国各地已有规模化种植，但病毒病已成为严重影响其产量和品质的主要因素。研究侵染百合的病毒种类及诊断检测技术，对控制百合病毒的发生危害具有重要意义。目前国外报道百合病毒病原有14种之多，但主要危害的有黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic uirus，CMV)、百合无症病毒(Lis2anptomless virus，LSV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、百合丛簇病等4种。在我国，尚未见有关侵染百合的CMV研究报道。本文经过一年多调查，发现浙江丽水和杭州的东方百合、亚洲百合等栽培品种普遍受到病毒侵染，由于百合种球来源不同，带毒情况复杂，田间发病症状呈多样化，复合侵染现象十分普遍。通过常规生物接种进行寄主反应测定，结合酶联免疫吸附(EIJSA)技术、&RNA检测技术、电镜负染色观察等，对侵染两地百合的CMV进行了检测诊断，并初步分析了田间样品的复合感染情况，为进一步应用分子生物学手段进行百合病毒种类的分子鉴定奠定了基础。

1材料和方法

1．1病毒材料的采集与保存

自然发病或无明显症状的东方百合[LiliumCVS．(Oriental Hybrids)]、亚洲百合[LiliumCVS．(AsiaticHybrids)]、百合铁亚杂种[Lilium cvs(L/A)]等各品种材料于2002年4一12月分别采自浙江省丽水市百合种植基地和杭州市郊等地，按照采集时间、百合品种等内容进行田间记录和编号，1～45号为东方百合，46～57号为亚洲百合，58—63号为百合铁亚杂种，64号甜百合为食用百合。部分样品将整株病株从田间移植到温室进行观察研究。

1．2ELlSA检测

参照马德芳的方法用抗体夹心ELISA法检测田间百合样品是否被黄瓜花叶病毒(CMV)侵染，CMV酶标抗体购自北京双赢世元生物技术公司。

1．3dsRNA检测

对经过CMV抗体ELISA检测呈阳性的一个东方百合样品(2号)提取dsRNA，进行l％琼脂糖凝胶电泳，以接种侵染番茄的CMV分离物FQS的心叶烟作为对照。

1．4感病组织汁液中线状病毒电镜检测

将经过ELISA检测的田间百合叶片组织在研钵中充分研磨至匀浆，用铜网蘸取组织粗汁液，直接用2％磷钨酸(PTA)负染色，在JEM—1200EX型透射电镜下观察线状病毒粒子的有无。

1．5寄主反应测定

取经过ELISA和dsRNA检测证实被CMV侵染的东方百合样品(2号)作为毒源，用常规汁液摩擦法接种于茄科(Solanaceae)、葫芦科(Cucuribita—ceae)、藜科(Chenopodiaceae)、苋科(Amaranthace—ae)、十字花科(Cruciferae)、豆科(1．eguminosae)等6科10种供试植物，以CMV-FQS株系作为对照同时接种上述10种植物，第l批接种试验重复3次，第2批接种试验重复2次，观察并记录症状发生情况，不能显示症状的植物用枯斑寄主检测其隐症带毒情况。

2结果

2．1百合病毒病的田间症状

受病毒侵染的百合田间症状多样，主要体现在叶、花、茎上(封面彩图，田间主要症状有斑驳、条斑、花叶、黄化坏死、花碎色、畸形、黄扁丛簇。)病害最为严重的是东方百合各品种。

2．2CMV抗体ELISA检测结果

对64个田间样品用CMV抗体进行E1．ISA检测，结果显示：64个样品中有26个样品呈阳性，CMV的检出率为40．6％(表1)。试验数据显示，来自百合上CMV的ELISA阳性反应较其他来源的CMV弱，OD值显示相对较低，表明百合CMV与其他来源的CMV在血清学上有一定的差异。

2．3dsRNA检测结果

通过对E1．ISA检测呈阳性反应的2号样品提取dsRNA，l％琼脂糖凝胶电泳图谱显示有大小为3 300nt、3 000nt、2 200nt左右的3条电泳条带，与作为对照的已知CMV(FQS)感染心叶烟上得到的ds RNA条带相同(图1)，表明2号百合样品中含有CMV，这与ELISA检测结果一致。

2．4百合样品线状病毒电镜检测结果

对64个田间百合样品进行电镜负染色观察发现有48个样品存在着线状病毒粒子，其中有23个样品同时检测到CMV(表1)，表明为线状病毒与CMV复合侵染，复合侵染率达35．9％。

2．5寄主反应测定结果

寄主接种试验结果显示，从百合病株上获得的CMV不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色藜、普通烟、心叶烟等指示植物，而作为对照毒株CMV(FQ5)则在这些指示植物上表现出典型的侵染症状(表2)，这表明侵染百合的CMV可能对百合植物产生了寄主适应性变异，丧失了通过汁液摩擦接种传播的特性。同时也表明复合侵染的线状病毒也不能通过汁液摩擦侵染这些指示植物。

3讨论

通过对浙江丽水、杭州两地田间百合各栽培品种EIASA检测，查明CMV在东方百合、亚洲百合、百合铁亚杂种及甜百合上普遍发生，感病率达40．6％。电镜观察，田间CMV感染的样品大多含有线状病毒，CMV与线状病毒的复合侵染率为35．9％，具有病毒多样性的特点。田间百合发病情况复杂，症状表现不规律，往往是多种症状复合表现。此外，发病症状还与温度有关，温度过低(<5℃)或过高(>30℃)时，症状表现不明显。寄主反应试验结果显示，从百合上获得的CMV分离物不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色藜、普通烟、心叶烟等常规CMV指示植物，可能是CMV长期侵染百合，发生了对自‘合植物的寄主适应性变异，完全丧失了通过汁液摩擦传播的特性。此外，在表现黄扁症状的百合植株中未检测到线状病毒和CMV，可能是其他病因所致。

CMV作为侵染百合的主要病毒之一，在世界上已有不少报道。Benetti等报道CMV在意大利百合上广泛发生，并且常与LSV复合侵染。Kim等用组织吸附免疫的方法检测侵染百合的CMV，并指出来自百合的分离物不能使茄科和葫芦科等易被CMV侵染的作物发病，是相对独立的一个类群。Cohen等报道CMV是以色列百合主要病毒之一。Korbin等研究了波兰观赏植物上的CMV分离物特性，发现百合等植物上分离的CMV不能通过汁液摩擦使CMV系统与鉴别寄主发病，丧失了通过汁液摩擦接种传播的特性。Masuta等报道了日本和韩国侵染百合的两个CMV分离物，其寄主范围仅限于百合，不能通过汁液摩擦接种传播。本试验结果与之吻合。

侵染百合的病毒寄主范围往往都比较窄。根据本研究结果，CMV在百合上已形成了株系分化，或在长期无性繁殖过程中丧失了通过汁液摩擦传播的能力，因而很难像侵染其他植物的CMV株系那样通过生物接种进行分离、鉴定与检测。在进行百合脱毒处理和病毒研究过程中需要结合分子杂交等其他分析手段进行诊断检测。因此，通过分子生物学方法对侵染百合的CMV以及其他病毒进行基因组序列研究，不仅可以确定其进化亲缘关系及产生寄主适应性变异的分子基础，同时也将为生产健康优质的百合提供条件。