高良姜素对膝关节炎大鼠软骨细胞自噬和凋亡的影响

关键词高良姜素；膝关节炎；软骨细胞；自噬；凋亡；AMPK/mTOR/ULK1信号通路

膝关节炎（kneeosteoarthritis，KOA）是临床上常见的一种慢性退行性疾病，以关节疼痛、畸形和功能障碍为特征，其进展缓慢，最终因疼痛和关节运动受损而导致患者活动能力丧失[1]。我国KOA的患病率为25.51%，且随着人口老龄化加剧和平均预期寿命延长，KOA的患病率将进一步上升[2]。目前，KOA患者的治疗以口服非甾体抗炎药为主，严重者需要进行全关节置换术来恢复关节功能；然而，药物只能暂时缓解症状，而手术是一种危险且昂贵的选择，效果有限[3]，加之学界对KOA的病因认识有限，因此有必要进一步阐明该病的生理病理，并开发新的治疗手段。

在细胞饥饿状态下，腺苷一磷酸活化的蛋白质激酶（adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）来激活UNC-51样激酶1（UNC-51-likekinase1，ULK1），从而触发软骨细胞自噬抑制细胞凋亡，参与调控KOA的疾病进展[4]。高良姜素（galangin，GLA）是一种重要的具有天然活性的类黄酮，具有抗炎、抗菌、抗氧化应激、抗纤维化、抗高血压等生物活性，对类风湿性关节炎、骨关节炎（osteoarthritis，OA）、骨质疏松症等疾病具有较好的疗效[5]。相关研究显示，GLA可通过调控AMPK/mTOR信号通路，促进细胞自噬，抑制细胞凋亡，从而减轻镉诱导的肾毒性[6]。然而，GLA在KOA中的作用机制尚不清楚。基于此，本研究通过探讨GLA调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对KOA大鼠软骨细胞自噬和凋亡的影响，以期为KOA的临床治疗提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

TalosF200XS型透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）购自北京欧波同光学技术有限公司；MACSQuant®VYB型流式细胞仪购自德国美天旎生物技术有限公司；LK-YG96型倒置显微镜购自天津徕科光学仪器有限公司；SH-523型凝胶成像系统购自杭州申花科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

GLA对照品（批号ES-1114S，纯度≥99%）购自上海玉博生物科技有限公司；AMPK抑制剂CompoundC对照品（批号orb1909567，纯度≥98%）购自武汉博欧特生物科技有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号G1120-10）购自北京祥生兴业科技有限公司；基质金属蛋白酶13（matrixmetalloproteinase13，MMP-13）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号分别为F16182、F15810）购自上海西唐生物科技有限公司；自噬检测试剂盒（批号A486454）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号JC-A80300）购自上海机纯实业有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（批号分别为KL-X126、KL-X122）购自上海康朗生物科技有限公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）、磷酸化AMPK（phosphorylatedAMPK，p-AMPK）、AMPK、磷酸化mTOR（phosphorylatedmTOR，p-mTOR）、mTOR、磷酸化ULK1（phosphorylatedULK1，p-ULK1）、ULK1抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（批号分别为ab181095、ab68206、ab271188、ab137133、ab32028、ab133766、ab177472、ab6721）购自英国Abcam公司。

1.3 实验动物

本研究所用动物为雄性SD大鼠，体重250～300g，购于武汉有度生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鄂）2021-0025。所有大鼠均置于温度24℃、湿度55%、12h光/暗循环的环境中自由进食和饮水。本实验经武汉有度生物科技有限公司动物伦理委员会审批（批件号2242930）。

2 方法

2.1 动物造模、分组与给药

将56只大鼠采用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于右后肢膝关节腔内侧切口后暴露关节腔，之后横切前交叉韧带，切除内侧半月板，然后将髌骨复位，缝合内侧囊切口，闭合皮肤。6周后，对大鼠进行X射线检查，若显示关节面粗糙变形，边缘有明显骨赘，内侧间隙变窄，软骨下骨的骨密度明显增高，则说明KOA模型构建成功[7]。另选择10只正常饲养的大鼠打开关节腔，但保持半月板完整，作为假手术组（即Sham组）。

将建模成功的大鼠分为模型组（即KOA组），GLA低、中、高剂量组（即L-GLA、M-GLA、H-GLA组，皮下注射100、200、400μg/kg的GLA[8]，临用时以二甲基亚砜溶解），GLA+CompoundC组（皮下注射400μg/kg的GLA+0.2mg/kg的AMPK抑制剂CompoundC[9]），每组10只。各给药组皮下注射相应药液，Sham组和KOA组大鼠注射等量的生理盐水，每天1次，连续给药21d。

2.2 大鼠膝关节肿胀程度检测

于给药第7、21天时，采用游标卡尺测量大鼠左右膝关节直径，计算右膝关节肿胀度（即右膝关节直径与左膝关节直径的差值）。

2.3 样品采集

测量完大鼠左右膝关节直径后，各组大鼠以颈椎脱臼法处死，于眼眶采集全血标本，分离血清，保存于－80℃。将右后肢膝关节软骨组织分成两部分：一部分置于10%多聚甲醛中固定，用于病理学观察；另一部分保存于－80℃，备用。

2.4 大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平检测

采用ELISA法检测。取“2.3”项下血清样品，按试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪于450nm波长处测定吸光度，并绘制MMP-13、IL-1β的标准曲线，然后计算大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平。

2.5 大鼠膝关节软骨组织病理学特征观察

取“2.3”项下固定的膝关节软骨组织适量，用水冲洗30min，在乙二胺四乙酸中室温脱钙4～6周，每周更换脱钙液，然后用水冲洗30min，用不同浓度的乙醇（50%～100%）脱水，再以二甲苯透明，经石蜡包埋后制成5μm切片；切片经苏木素染色10min，再以伊红染色3～5min，然后在显微镜下观察其病理学特征。

2.6 大鼠软骨细胞自噬观察

取“2.3”项下冻存的膝关节软骨组织适量，修剪为1mm×1mm×1mm大小，在四氧化锇（1%）中固定3h，经脱水、包埋后，切成70nm厚的薄片，再以柠檬酸铅、醋酸铀进行双重染色，然后采用TEM观察，并统计自噬空泡数。

2.7 大鼠软骨细胞凋亡检测

取“2.3”项下冻存的膝关节软骨组织适量，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加入500μL结合缓冲液重悬，再加入5μLAnnexinⅤ-FITC试剂和5μL碘化丙啶（PI），室温下黑暗反应15min，采用流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况，并计算凋亡率（凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×100%）。

2.8 大鼠膝关节软骨组织中AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白表达检测

采用Westernblot法检测。取“2.3”项下冻存的膝关节软骨组织适量，用RIPA裂解液裂解，提取总蛋白，采用BCA试剂盒检测上清液中的蛋白浓度。蛋白经变性处理后，取50μg至10%十二烷基硫酸钠凝胶上，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的样品转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST在室温下阻断1h，加入β-actin（稀释度为1∶1000）、p-AMPK（稀释度为1∶2000）、AMPK（稀释度为1∶1000）、p-mTOR（稀释度为1∶1000）、mTOR（稀释度为1∶1000）、p-ULK1（稀释度为1∶1000）、ULK1（稀释度为1∶10000）一抗在4℃下孵育过夜；用TBST洗涤10min，加入二抗（稀释度为1∶5000）在室温下孵育1h，使用ECL试剂盒进行显色、成像。使用ImageJ软件进行分析，以β-actin为内参进行归一化，以p-AMPK与AMPK、p-mTOR与mTOR、p-ULK1与ULK1的比值表示AMPK、mTOR、ULK1的磷酸化水平。

2.9 统计学方法

采用SPSS26.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 GLA对KOA大鼠膝关节肿胀程度的影响

GLA处理7、21d后，KOA组大鼠膝关节肿胀程度均显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA组大鼠膝关节肿胀程度均显著低于KOA组，且具有剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+CompoundC组大鼠膝关节肿胀程度显著高于H-GLA组（P＜0.05）。结果见表1。

3.2 GLA对KOA大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平的影响

KOA组大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA组大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均显著低于KOA组，且具有剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+CompoundC组大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平均显著高于H-GLA组（P＜0.05）。结果见表2。

3.3 GLA对KOA大鼠膝关节软骨组织病理学的影响

Sham组大鼠膝关节软骨细胞排列整齐、形态规则，组织结构完整，无炎症细胞浸润；KOA组大鼠膝关节软骨细胞排列紊乱，细胞核固缩，关节软骨层纤维化严重，伴有大量炎症细胞浸润；与KOA组相比，L-GLA、MGLA、H-GLA组大鼠膝关节软骨损伤得到明显改善，炎症细胞浸润减轻，且呈现剂量依赖趋势；与H-GLA组相比，GLA+CompoundC组大鼠膝关节软骨损伤加重，炎症细胞浸润加重。结果见图1。

3.4 GLA对KOA大鼠软骨细胞自噬的影响

KOA组大鼠软骨细胞自噬空泡数显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA组大鼠软骨细胞自噬空泡数显著高于KOA组，且具有剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+CompoundC组大鼠软骨细胞自噬空泡数显著低于H-GLA组（P＜0.05）。结果见图2、表3。

3.5 GLA对KOA大鼠软骨细胞凋亡的影响

KOA组大鼠软骨细胞凋亡率显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA组大鼠软骨细胞凋亡率显著低于KOA组（P＜0.05），且具有剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+CompoundC组大鼠软骨细胞凋亡率显著高于H-GLA组（P＜0.05）。结果见表3、图3。

3.6 GLA对KOA大鼠膝关节组织中AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白表达的影响

KOA组大鼠膝关节组织中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均显著低于Sham组，mTOR蛋白的磷酸化水平显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA组大鼠膝关节组织中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均显著高于KOA组，mTOR蛋白的磷酸化水平显著低于KOA组（P＜0.05），且具有剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+CompoundC组大鼠膝关节组织中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均显著低于H-GLA组，mTOR蛋白磷酸化水平显著高于H-GLA组（P＜0.05）。结果见图4、表4。

4 讨论

OA是全球致残疾病的主要原因，临床上膝关节是最常见的OA部位[10]。KOA的发病机制复杂，包括机械负荷、炎症、代谢改变、细胞衰老等，这些因素共同导致滑膜关节的结构恶化和功能衰竭，其中炎症反应在KOA的发展中起着至关重要的作用[2]。关节损伤会导致无菌性炎症，而高水平的炎症因子，如MMP-13、IL-1β等，可增强破骨细胞分化，导致软骨细胞凋亡和软骨退变[11]。自噬是一种重要的细胞功能，可通过降解冗余或受损的蛋白质和细胞器来保护细胞免于凋亡。在KOA的进展过程中，软骨细胞的自噬活性存在缺陷，导致细胞凋亡增加，从而加剧KOA的病理进程[12]。因此，探讨KOA软骨细胞自噬和凋亡相关的分子机制，对寻找新的治疗靶点和药物至关重要。本研究构建KOA大鼠模型后发现，大鼠关节肿胀、炎症因子表达升高，软骨细胞自噬空泡数、凋亡率增加，关节软骨细胞排列紊乱，且伴有大量炎症细胞浸润，说明KOA伴随着明显的炎症反应，存在细胞自噬和细胞凋亡，表现出膝关节自噬损伤。

研究发现，提取自中药高良姜根部的GLA可以调控软骨细胞，参与OA的进展[13]。相关研究显示，GLA可通过抑制氧化应激，减弱软骨细胞外基质降解，从而改善OA进展[14]。此外，有研究表明，GLA在体外可抑制IL-1β诱导的炎症反应，在体内可改善软骨退行性变化，可作为治疗OA的潜在新药物[15]。GLA还可在体内抑制类风湿性关节炎的发展，可作为治疗类风湿性关节炎的潜在新药物[16]。本研究结果显示，GLA可促进大鼠软骨细胞自噬，抑制细胞凋亡和炎症反应，减轻软骨细胞的炎症浸润。这提示GLA可能通过抑制炎症反应，促进软骨细胞自噬，抑制细胞凋亡，进而减轻KOA组织损伤。

研究表明，AMPK/mTOR/ULK1信号通路在自噬和凋亡中具有重要作用：AMPK可直接磷酸化mTOR，导致mTOR活性下调；还可通过调节ULK1泛素化，促进细胞自噬，抑制细胞凋亡[17]。Xiao等[18]研究发现，基烯醇可以通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路，促进急性肺损伤细胞自噬，减轻脂多糖诱导的肺部炎症和白细胞浸润。吴伟欣等[19]研究发现，龟鹿二仙胶可通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路诱导自噬，减少软骨细胞凋亡，对KOA具有较好的治疗效果。蔡猛等[20]研究发现，牛蒡子苷元可激活AMPK/ULK1信号通路，促进OA细胞自噬，抑制软骨细胞焦亡，减轻关节软骨组织损伤。本研究结果显示，KOA组大鼠膝关节组织中AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均低于Sham组，mTOR蛋白的磷酸化水平高于Sham组，这提示AMPK/mTOR/ULK1信号通路被抑制，可能是KOA发生的重要原因。经GLA干预后，AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平均高于KOA组，mTOR蛋白的磷酸化水平低于KOA组；进一步以AMPK抑制剂CompoundC干预后发现，其可逆转GLA对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的激活作用。这提示，GLA可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路，促进KOA大鼠软骨细胞自噬，抑制细胞凋亡，从而改善KOA组织损伤。

综上所述，GLA可促进KOA大鼠软骨细胞自噬，抑制细胞凋亡，其作用机制可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关。