从“非主流”到“主流”的华丽转身：miRNA如何逆天改命

微RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，在不同的细胞活动及生命进程中都发挥重要的调控作用。1993年，安布罗斯（V.Ambros）和鲁夫昆（G.Ruvkun）在《细胞》（Cell）杂志以背靠背形式发表两篇研究论文[1，2]，惊人地发现秀丽隐杆线虫（C.elegans，以下简称线虫）中22个核苷酸的lin-4竟能与lin-14mRNA的3’UTR部分互补，从而抑制其翻译成蛋白质。然而，由于lin-4仅存在线虫中，这一重要发现被当时的科学界所忽视。7年后，鲁夫昆团队在线虫中发现第二个miRNA——let-7，不仅能靶向lin-413’UTR降低其表达，而且在果蝇和斑马鱼等动物界高度保守[3]。随后，成千上万的miRNA在人以及小鼠、拟南芥等动植物中被发现，由此开启了RNA调控基因的全新领域。目前，miRNA靶向抑制基因理论已经成为经典，但却让miRNA研究由“热”转“冷”。近些年，核内miRNA靶向增强子激活基因理论正悄然兴起，能否借诺贝尔奖之东风掀起miRNA研究的新浪潮，让我们拭目以待！

兴趣碰撞开启miRNA新纪元

1953年，安布罗斯出生于美国新罕布什尔州，家里有8个孩子，其父亲是波兰人，因躲避战火连中学都没有念完。他为父亲感到惋惜，懂得珍惜学习机会，自小立志成为一名科学家。他在申请麻省理工学院（MIT）读书时就表明，“我想当个科学家”。随后，他进入MIT学习天文，但发现自己对物理学兴趣一般，在室友的熏陶下，痴迷于揭示分子生物与基因组学的奥秘，彻底爱上了分子生物学。在博士期间，他师从巴尔的摩教授（D.Baltimore，1975年获诺贝尔生理学或医学奖），研究脊髓灰质炎病毒的基因组结构和复制。在此期间，霍维茨教授（H.R.Horvitz，2002年获诺贝尔生理学或医学奖）来到MIT建立实验室，进行了线虫研究的学术报告，让安布罗斯对线虫产生浓厚兴趣。1979年，他加入霍维茨实验室进行博士后训练，研究lin-4和unc-86对线虫发育的调控作用。

1952年，鲁夫昆出生在美国加州伯克利市的犹太家庭，其父母鼓励他对科学的热爱。童年时期，他对科学充满兴趣，因爱好无线电，对电子学和物理学很着迷，后来他进入加州大学伯克利分校学习电气工程。1973年，鲁夫昆获得学士学位，恰逢经济萧条，对未来困惑不已。于是，他买了一辆面包车，沿美国西海岸旅行直到玻利维亚，曾尝试应聘电台DJ等工作都未成功，最后得到酒吧的种树工作，与满怀理想的年轻嬉皮士共同种树和生活。然而，一次偶然的机会，他被《科学美国人》杂志所吸引，内心科研的火种被再次点燃，命运的齿轮也由此反转。1976年，他返回美国进入哈佛大学攻读博士学位，师从植物分子生物学家奥苏贝尔（F.Ausubel），并共同解开了植物固氮的诸多谜团。1982年，他获得生物物理学博士学位后，决定改变研究方向，在哈佛大学吉尔伯特（W.Gilbert，1980年获诺贝尔化学奖）和MIT的霍维茨实验室进行博士后研究，关注线虫发育相关的信号通路，并与安布罗斯相遇。

1980年代，安布罗斯和鲁夫昆在霍维茨实验室中共同探究lin-14在线虫发育中的作用机制，但并未解开未知之谜。随后，他们分别加入哈佛大学的不同团队继续聚焦lin-14研究，尽管两人保持相对独立，但又紧密合作。后来，安布罗斯和鲁夫昆分别独立推导lin-4和lin-14的序列信息，在1992年6月11日晚上交换彼此的结果，对比后惊奇地发现，lin-4非编码RNA在lin-14mRNA的3’UTR存在多个结合位点，像拉链一样吻合。两个团队进一步证实lin-4通过结合在lin-14mRNA的3’UTR抑制其翻译，并于1993年将论文同时发表在《细胞》杂志上[1，2]。一种以miRNA为媒介的新型基因调控方式被发现，但当时并未引起科学界的关注。直到2000年，鲁夫昆团队证实线虫中let-7在动物界具有高度保守性[3]，突显了miRNA抑制基因的普适性，才正式开启miRNA研究新领域。

miRNA掌控细胞命运转换

研究表明，miRNA生成是一个被精心编排的生物学过程。首先，在细胞核内，基因组DNA转录产生长链的初级miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），通常包含一个或多个发夹状结构，是miRNA成熟的关键信号。接着，DGCR8蛋白与Drosha酶等相互作用并结合pri-miRNA，Drosha酶将pri-miRNA剪切成约70个核苷酸长的前体miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。然后，pre-miRNA在exportin-5蛋白协助下，从细胞核被转运至细胞质，被Dicer酶进一步剪切形成双链RNA，与AGO蛋白组成miRNA诱导的沉默复合体（miRNA-inducedsilencingcomplex，miRISC）并完成双链解旋，最终导致RNA双链中仅有一条链与AGO蛋白稳定结合，该链被称为引导链，即成熟miRNA。目前，最全面的miRNA公共数据库——miRBase已收录来自271个物种、超过4万个miRNA的信息，其中，人类miRNA共1917个，可能在疾病和发育进程中起重要的调控作用。

首个miRNA——lin-4的发现过程

miRNA通过调控基因表达影响细胞增殖、分化和凋亡等生物学功能，在个体发育、行为表现以及疾病发生发展中至关重要。例如，最早发现的两个miRNA——lin-4和let-7都能调控线虫的发育时序。其中，lin-4通过抑制lin-14和lin-28表达，分别调控线虫L1～L2期和L2～L3期的转变[1]；let-7通过调控lin-41、hbl-1等靶基因，调控线虫从L4期到成虫的转变[4]。另外，miR-iab4/iab8突变则显著影响果蝇幼虫的自我纠正能力[5]，进而影响其行为表现。然而，miRNA表达异常则导致靶基因表达失控，与肿瘤、自身免疫性疾病以及神经退行性疾病等密切相关。以乳腺癌为例，低表达的miR-339通过降低抑癌基因表达促进乳腺癌发生发展[6]。那么，miRNA如何影响个体发育和疾病进程呢？

我们认为，miRNA通过改变时空维度上细胞的身份及状态影响发育和疾病过程。事实上，miRNA具有很强的组织细胞特异性，如肌肉特异性miR-1和肝脏特异性miR-122等。其中，小鼠miR-122随着胚胎发育逐渐升高，在出生时急剧升高，这与出生后肝脏代谢功能密切相关。另外，小鼠被敲除miR-122后导致脂肪在肝脏积累，逐渐获得脂肪细胞储肪功能，丢失部分肝脏细胞排除脂肪的能力，引起肝炎，最终在11月龄时发展成肝癌。此外，miR-17～92家族参与Th细胞身份的塑造，而miR-7在成熟的胰腺β细胞身份维持中发挥重要作用。因此，miRNA组织特异性表达的特征与细胞特定身份密切相关，其异常表达会造成细胞身份转变及疾病发生与进展，但具体作用机制尚不完全清楚。

NamiRNA打破基因沉默的魔咒

目前，沉默基因表达是miRNA调控基因的经典途径，主要发生在转录后水平。在细胞质中，成熟miRNA与AGO蛋白形成miRISC复合体并通过碱基互补配对原则与mRNA结合，负向调节其翻译效率和稳定性抑制基因表达。一方面，miRISC复合体通过阻止翻译起始因子被招募到mRNA的5’端非编码区或者影响核糖体沿mRNA的移动，抑制核糖体的翻译[7]。另一方面，miRISC复合体会激活去腺苷化酶，将mRNA3’端的多腺苷酸尾切除，进一步导致mRNA的5’端帽结构丢失，加速mRNA被核酸外切酶降解，降低基因表达。然而，动植物中miRNA与mRNA的结合方式并不完全相同。在植物中，miRNA常以完全匹配的方式结合mRNA并形成稳定的双链结构沉默基因表达，而在动物中，miRNA与mRNA的结合通常是不完全匹配的，极大增加miRNA抑制靶标结合位点预测的复杂性和难度[8]。与此相反，miRNA能与启动子相互作用以非经典途径在转录水平上激活基因表达。例如，细胞核中的miR-373能够与E-钙黏蛋白基因的启动子区域序列互补并促进mRNA的转录，揭示miRNA更为复杂的生物学功能。

近些年，复旦大学于文强团队发现了一种全新的非经典途径——细胞核内miRNA靶向增强子激活基因转录，并将这类miRNA命名为核内激活miRNA（nuclearactivatingmiRNA，NamiRNA）。2009年，该团队发现大多数miRNA在基因组位置上与基因激活元件增强子高度重叠，提示miRNA可能具有激活基因的功能。经过8年潜心研究，团队证实miRNA能够定位于细胞核内，并揭示了核内miRNA激活基因的功能机制，创造性地提出了NamiRNA-增强子-基因激活的全新理论[9，10]。NamiRNA指的是一类在细胞核内的miRNA，能够通过与增强子相互作用促进基因转录。具体来说[10]，miRNA作为楔子，打开基因组DNA双链，AGO2识别增强子与miRNA的杂交链，维持DNA单链状态，促进RNA聚合酶Ⅱ对基因的转录。事实上，NamiRNA不仅能够激活与其位置相邻的靶基因表达，还能够激活全基因组范围内的基因表达，从而影响细胞身份及功能改变。NamiRNA的发现开启了一个新的研究领域，实现了miRNA从沉默基因到激活基因的华丽转身，为miRNA的基础研究和临床应用转化提供了新的视角和方向。

核内miRNA激活基因的作用模式图

借诺贝尔奖东风创miRNA研究新浪潮

截至2024年12月，PubMed检索“miRNA”文章已超过17万篇，涵盖病毒、细菌、真菌、植物和动物自然界五大类生物，不仅揭示了miRNA调控微生物繁殖及对宿主的作用，而且探究了miRNA在动植物的发育及不同疾病过程的重要作用，尤其在miRNA的生成加工过程、生物功能以及基因调控模式等方面都取得很大进展。然而，miRNA文章自2021年开始逐年减少，2024年发文总量锐减近50%，似乎意味着miRNA研究正由“盛”转“衰”，其背后原因值得我们深思。

首先，miRNA的基础研究似乎早已陷入“科研怪圈”：过表达miRNA能够诱导基因的差异表达，但大多数研究者仅仅关注下调的基因，对上调基因视而不见。相应地，miRNA上调基因的研究少之又少，且主要是miRNA通过沉默中间基因导致下游基因的上调。那么，miRNA能否激活基因？如前所述，答案是肯定的。如何探究其正向的基因调控作用呢？NamiRNA-增强子-基因激活理论为科研工作者指明了具体方向，细胞核内的miRNA可以作为激活剂，活化基因组增强子并与其相互作用，打开DNA双链，激活基因转录。目前，NamiRNA研究尚处于早期阶段，还有诸多未知值得深入探究。我们相信，在不远的未来，NamiRNA研究的新生力量必将涌现，共同实现miRNA基础研究的繁荣与复兴！

其次，miRNA的临床应用似乎总是“扑朔迷离”，尤其是成药极其困难。2008年，丹麦制药公司SantarisPharma宣布SPC3649（Miravirsen）进入临床试验，是全球首个靶向miRNA的核酸药物，能特异性结合miR-122，旨在降低丙肝病毒（hepatitisCvirus，HCV）载量。随后的临床Ⅱ期试验显示，该药物用于慢性丙肝病毒感染患者呈现剂量依赖性的丙肝病毒RNA的降低[11]，但后报道称Miravirsen会诱导HCV的UTR区域突变，没有进一步的进展。2016年，首个miR-34a类似物MRX34的多中心临床I期试验因严重的免疫副作用致死而终止[12]。目前，尚无临床可用的靶向miRNA核酸药物。近些年，核酸药物的修饰以及递送系统已取得巨大进步，不仅能降低核酸药物的免疫原性，而且能促进其向靶组织器官的运输。那么，决定miRNA成药的关键是什么呢？我们认为，靶点筛选是miRNA成药的核心，而筛选策略是重中之重。与经典抑制理论不同，NamiRNA-增强子-基因激活理论让我们更关注miRNA对全基因组的激活作用，有望引领一种全新的miRNA筛选潮流，突破miRNA成药难的困境。我们期待，药物研发团队及生物医药企业能够重拾信心，提升靶向miRNA核酸药物的研发投入，加快miRNA的临床应用转化！

借着诺贝尔奖的东风，miRNA研究2.0时代已经开启，让我们共同努力，推动基础研究向临床应用的转化，催生临床可用的靶向miRNA核酸药物，为人类与疾病的斗争贡献力量！

[1]LeeRC，FeinbaumRL，AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell，1993，75（5）：843-854.

[2]WightmanB，HaI，RuvkunG.Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.Cell，1993，75（5）：855-862.

[3]PasquinelliAE，ReinhartBJ，SlackF，etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature，2000，408（6808）：86-89.

[4]ReinhartBJ，SlackFJ，BassonM，etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature，2000，403（6772）：901-906.

[5]Picao-OsorioJ，JohnstonJ，LandgrafM，etal.MicroRNA-encodedbehaviorinDrosophila.Science，2015，350（6262）：815-820.

[6]LiangY，LuQ，LiW，etal.ReactivationoftumoursuppressorinbreastcancerbyenhancerswitchingthroughNamiRNAnetwork.NucleicAcidsResearch，2021，49（15）：8556-8572.

[7]MeijerH，KongY，LuW，etal.TranslationalrepressionandeIF4A2activityarecriticalformicroRNA-mediatedgeneregulation.Science，2013，340（6128）：82-85.

[8]LewisBP，ShihIH，Jones-RhoadesMW，etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets.Cell，2003，115（7）：787-798.

[9]XiaoM，LiJ，LiW，etal.MicroRNAsactivategenetranscriptionepigeneticallyasanenhancertrigge.RNABiology，2017，14（10）：1326-1334.

[10]YangS，ZouQ，LiangY，etal.miR-1246promotesosteosarcomacellmigrationviaNamiRNA-enhancernetworkdependentonArgonaute2.MedComm，2024，5（4）：e543.

[11]JanssenHL，ReesinkHW，LawitzEJ，etal.TreatmentofHCVinfectionbytargetingmicroRNA.NewEnglandJournalofMedicine，2013，368（18）：1685-1694.

[12]HongDS，KangYK，BoradM，etal.Phase1studyofMRX34，aliposomalmiR-34amimic，inpatientswithadvancedsolidtumours.BritishJournalofCancer，2020，122（11）：1630-1637.

关键词：诺贝尔奖miRNA沉默基因NamiRNA基因激活■