益母草碱调节GAS6/Axl信号通路对冠心病大鼠心肌损伤的影响

关键词益母草碱；GAS6/Axl信号通路；冠心病；心肌损伤

冠心病属于心血管相关疾病，具有高致残率及高致死率，其主要是由于沉积物积聚促使冠状动脉狭窄、阻塞，引发心肌组织缺氧、缺血、坏死等损伤，导致患者出现心绞痛、心悸、呼吸急促、乏力等症状，若不及时治疗，还可加剧损伤，引发心肌梗死、心力衰竭，甚至威胁患者的生命安全[1]。目前，冠心病的临床治疗主要通过服用防血栓类药物以防止冠状动脉阻塞，但现有治法服药周期长且难以消除病根，因此迫切需要寻求新型特效药以缓解患者病情[2]。

益母草碱提取自中药益母草，具有降血脂、溶栓、保护心血管等多种药理作用，被广泛应用于心血管相关疾病的治疗。已有研究显示，益母草碱可减轻血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导的小鼠心脏肥大、纤维化和炎症，抑制心脏损伤和功能障碍，改善心功能[3]。生长停滞特异性蛋白6（growtharrest-specificprotein-6，GAS6）/酪氨酸蛋白激酶受体（Axl）信号通路在维持心脏正常功能中具有重要作用，激活GAS6/Axl-AMP活化蛋白质激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）信号通路可抑制过氧化氢诱导的心肌细胞氧化应激损伤，抑制心肌细胞凋亡[4]。本研究通过探究益母草碱对GAS6/Axl信号通路的影响，阐明其减轻冠心病大鼠心肌损伤的机制，以期为冠心病的治疗寻求新策略。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括ReadMax1500型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）、RX50型显微镜[思科诺思生物科技（北京）有限公司]、4200SF型凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

益母草碱对照品（批号yb-019，纯度≥98%）购自上海钰博生物科技有限公司；GAS6/Axl信号通路抑制剂R428对照品（批号ab141364，纯度＞98%）购自英国Abcam公司；肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号分别为ER006、ER008-16、ER003-48）均购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、肌钙蛋白Ⅰ（troponinⅠ，cTnⅠ）、肌红蛋白（myoglobin，Mb）ELISA试剂盒（批号分别为JLC15558、JLC14924、JLC15548）均购自江西江蓝纯生物试剂有限公司；兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）、B细胞淋巴瘤2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗体（批号分别为LM-0081R、LM0057）均购自上海联迈生物工程有限公司；兔源GAS6抗体（批号BKKT17001）购自上海帛科生物技术有限公司；兔源磷酸化Axl（phosphorylatedAxl，p-Axl）、Axl抗体（批号分别为kl-5181R、kl230Ra21）均购自上海康朗生物科技有限公司；兔源剪切型caspase-3（cleaved-caspase-3）抗体（批号9661T）购自上海远慕生物科技有限公司；兔源Bcl-2抗体（批号FNab00839）购自武汉菲恩生物科技有限公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号k10085）购自北京百奥莱博科技有限公司；TUNEL试剂盒（批号Y1040S）购自优利科（上海）生命科学有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（批号B1061）购自北京普利莱基因技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白G二抗（批号abs20002）购自爱必信（上海）生物科技有限公司。

1.3 实验动物

60只7周龄、体重（200±20）g的SPF级正常健康雄性SD大鼠[动物生产许可证号SCXK（豫）2022-0001]购自河南省实验动物中心。所有大鼠饲养于温度21～23℃、相对湿度55%、12h光/12h暗交替的环境中，饲养期间自由摄食、饮水。本研究方案已获得河南利欣制药股份有限公司动物伦理委员会审批（审批号2022-030195）。

2 方法

2.1 冠心病大鼠模型构建

大鼠适应性喂养1周后，选取12只正常健康大鼠喂养普通饲料作为对照组。剩余48只大鼠进行冠心病造模，具体造模方法及成模判断标准如下：先以高脂饲料（87.3%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇+0.5%牛磺胆酸钠+0.2%丙基硫氧嘧啶）喂养6周，再连续注射5mg/（kg·d）盐酸异丙肾上腺素3d，每天1次。大鼠注射药物期间仍用高脂饲料喂养。注射3d后，用30mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠并连接心电图，观察其心电图ST段变化，当ST段抬高≥0.1mV表明冠心病大鼠模型构建成功[5]。

2.2 分组与给药

将造模成功的48只大鼠按随机抽样方法分为模型组，益母草碱低、高剂量组（益母草碱-L、益母草碱-H组，分别灌胃25、100mg/kg的益母草碱+腹腔注射75mg/kg的生理盐水[6]），益母草碱高剂量+GAS6/Axl信号通路抑制剂组（益母草碱-H+R428组，灌胃100mg/kg的益母草碱+腹腔注射75mg/kg的R428[7]），每组12只。各给药组大鼠给予相应药物，对照组和模型组大鼠灌胃并腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，连续48d。

2.3 大鼠心功能检测

给药结束后24h，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，超声心动图监测5个周期（1个周期0.10～0.16s）的左室射血分数（leftventricularejectionfraction，LVEF），取均值作为最终结果，计算左室短轴缩短率（leftventricularfractionalshortening，LVFS）及二尖瓣环舒张早期与舒张晚期运动速度之比（ratioofearly-diastolicandlate-diastolicmotionvelocityofthemitralring，Em/Am）。LVFS＝（左心室的舒张末期内径－左心室的收缩末期内径）/左心室的舒张末期内径×100%。

2.4 大鼠血清中炎症因子及心肌损伤标志物水平检测

心功能检测结束后，各组大鼠腹主动脉取血，静置后离心，取血清，按照相应ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）及心肌损伤标志物（CK-MB、cTnⅠ、Mb）水平。

2.5 大鼠心肌组织病理形态观察

取血结束，处死大鼠，取心肌组织。每组选择6只大鼠的心肌组织，制成石蜡切片（厚5μm），行常规HE染色，显微镜下观察心肌组织病理形态。其余心肌组织置于－20℃冰箱中冷冻保存。

2.6 大鼠心肌组织细胞凋亡率检测

取“2.5”项下各组大鼠的心肌组织石蜡切片，常规脱蜡至水后进行TUNEL染色、DAPI染色，具体操作参照试剂盒说明书；脱水后透明密封，显微镜下观察心肌组织细胞凋亡情况（凋亡细胞呈红色）。计算心肌组织细胞凋亡率：细胞凋亡率（%）＝TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

2.7 大鼠心肌组织中凋亡及GAS6/Axl信号通路相关蛋白表达检测

取各组剩余6只大鼠的心肌组织，研碎后加入蛋白裂解液在冰上充分裂解，提取总蛋白并进行定量，沸水浴变性。取变性蛋白，在电压60V下电泳分离4～5h，然后在电压60V下湿转2h至硝酸纤维素膜，封闭液室温摇床封闭1h。将膜与cleaved-caspase-3、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAS6、p-Axl、Axl、β-actin一抗（其中cleavedcaspase-3、caspase-3抗体的稀释比例均为1∶1000，其余一抗的稀释比例均为1∶2000）在4℃下共孵育8h；洗膜后，将膜与HRP标记的二抗（稀释比例1∶10000）在37℃下共孵育1h。经可视化处理后，凝胶成像系统采集图像，并使用Image软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，并计算cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值。

2.8 统计学方法

采用SPSS25.0软件对数据进行统计分析。实验数据均符合正态分布，以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 大鼠心功能测定结果

模型组大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均较对照组显著降低（P＜0.05）；益母草碱各剂量组大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均较模型组显著升高（P＜0.05），且益母草碱-H组上述指标变化均较益母草碱-L组更明显（P＜0.05）；益母草碱-H+R428组大鼠LVEF、LVFS、Em/Am均较益母草碱-H组显著降低（P＜0.05）。结果见表1。

3.2 大鼠血清中炎症因子水平测定结果

模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较对照组显著升高（P＜0.05）；益母草碱各剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较模型组显著降低（P＜0.05），且益母草碱-H组上述指标变化均较益母草碱-L组更明显（P＜0.05）；益母草碱-H+R428组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较益母草碱-H组显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

3.3 大鼠血清中心肌损伤标志物水平测定结果

模型组大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均较对照组显著升高（P＜0.05）；益母草碱各剂量组大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均较模型组显著降低（P＜0.05），且益母草碱-H组上述指标变化均较益母草碱-L组更明显（P＜0.05）；益母草碱-H+R428组大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ、Mb水平均较益母草碱-H组显著升高（P＜0.05）。结果见表3。

3.4 大鼠心肌组织病理形态观察结果

对照组大鼠心肌细胞与心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态正常、大小均匀，无炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞与纤维排列紊乱，细胞肥大，细胞核固缩，细胞数量减少，大量炎症细胞浸润；与模型组相比，益母草碱各剂量组大鼠心肌细胞与纤维排列相对整齐，细胞形态相对正常，细胞数量增多，炎症细胞浸润减少；与益母草碱-H组比较，益母草碱-H+R428组大鼠心肌组织损伤严重，细胞及纤维排列紊乱，细胞异常肥大，细胞数量减少，炎症细胞浸润明显。结果见图1。

3.5 大鼠心肌组织细胞凋亡率测定结果

模型组大鼠心肌组织细胞凋亡率[（34.69±3.56）%]较对照组[（1.53±0.19）%]显著升高（P＜0.05）；益母草碱-L组、益母草碱-H组大鼠心肌组织细胞凋亡率[分别为（21.25±2.34）%、（9.44±9.87）%]均较模型组显著降低（P＜0.05），且益母草碱-H组大鼠上述指标变化较益母草碱-L组更明显（P＜0.05）；益母草碱-H+R428组大鼠心肌组织细胞凋亡率[（18.67±1.93）%]较益母草碱-H组显著升高（P＜0.05）。结果见图2。

3.6 大鼠心肌组织中凋亡及GAS6/Axl信号通路相关蛋白表达测定结果

模型组大鼠心肌组织中cleaved-caspase-3/caspase-3比值较对照组显著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相对表达量均较对照组显著降低（P＜0.05）；益母草碱各剂量组大鼠心肌组织中cleavedcaspase-3/caspase-3比值均较模型组显著降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相对表达量均较模型组显著升高（P＜0.05），且益母草碱-H组大鼠上述指标变化均较益母草碱-L组更明显（P＜0.05）；益母草碱-H+R428组大鼠心肌组织中cleaved-caspase-3/caspase-3比值较益母草碱-H组显著升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax、p-Axl/Axl比值及GAS6蛋白相对表达量均较益母草碱-H组显著降低（P＜0.05）。结果见图3、表4。

4 讨论

冠心病是引发心血管相关死亡的主要因素，其主要是由于血脂沉积造成冠状动脉狭窄阻塞，促使心肌缺血缺氧，造成组织坏死，同时大量巨噬细胞浸润，释放炎症因子，引发应激反应，加剧心肌缺血缺氧性损伤[8]。寻求冠心病的特效治疗药物至关重要。中药益母草前期主要应用于治疗痛经、恶露、更年期综合征、阴道异常出血等妇科相关疾病，后期证实其在治疗心肌梗死、缺血性脑卒中、动脉粥样硬化等相关心脑血管疾病中发挥降血脂、溶栓、保护心血管等多种作用，而提取自益母草的主要活性生物碱益母草碱在其中发挥至关重要的作用[9]。已有研究显示，益母草碱可通过减少梗死相关酶的释放、心肌细胞的凋亡，缩小梗死面积，改善心功能，对心肌缺血再灌注损伤具有改善作用[10]；同时，益母草碱还可抑制心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡，改善心功能[11]。LVEF、LVFS、Em/Am是检测心功能的常用指标，可以直观反映心功能情况，而心肌损伤标志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平可以反映心肌损伤程度。本研究中，冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平降低，CK-MB、cTnⅠ、Mb水平升高，心肌组织发生损伤；而益母草碱给药后可升高冠心病大鼠的LVEF、LVFS、Em/Am水平，降低其血清中心肌损伤标志物CK-MB、cTnⅠ、Mb水平。这说明益母草碱可改善心功能，减轻心肌损伤，对冠心病大鼠具有心肌保护作用。

冠心病的发生发展受多种因素影响，其中炎症及细胞凋亡均与冠心病心肌损伤息息相关：当心肌组织受到缺血缺氧刺激时，心肌组织发生坏死，炎症细胞浸润加剧，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子大量释放，进而促使细胞线粒体发生损伤，释放大量细胞色素C，促进促凋亡蛋白Bax表达，然后激活并活化caspase-3，促进细胞凋亡，加剧心肌损伤[12―13]。抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax两者相互拮抗，共同调控细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值可以反映细胞内凋亡与抗凋亡的平衡状态；cleavedcaspase-3作为caspase-3的活化形式，是执行细胞凋亡的关键蛋白，cleaved-caspase-3/caspase-3比值可以反映细胞凋亡程度。已有研究显示，降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平可缓解内皮组织炎症反应，减少血管内皮活性物质表达，从而缓解内皮细胞损伤，减少心肌细胞凋亡，减轻心肌组织损伤，改善冠心病患者病情[14]。抑制TNF-α、IL-6水平，下调caspase-3、Bax表达，可抑制炎症反应，减少心肌细胞凋亡，减轻冠心病大鼠心肌损伤[15]。本研究结果显示，益母草碱可降低冠心病大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，降低cleaved-caspase-3/caspase-3、Bcl-2/Bax比值，抑制炎症反应，减少心肌细胞凋亡，进而减轻心肌损伤。

GAS6/Axl信号通路参与调控多种生理病理进程，包括心肌保护，并在其中发挥关键作用。其中，维生素K依赖性蛋白家族成员GAS6参与动脉粥样硬化及冠状动脉炎性损伤的发生发展，当机体受到刺激时，GAS6可被激活，使其结合并磷酸化激活细胞膜表面的Axl，进而激活下游多条效应通路，抑制炎症发生及细胞凋亡等，从而抑制心肌损伤[16]。已有研究显示，激活GAS6/Axl-含NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3信号通路，可抑制炎症反应，减少心肌细胞凋亡，改善脓毒症小鼠心功能[17]。另外，激活GAS6/Axl-AMPK信号通路可抑制炎症反应与细胞凋亡，改善心功能和脓毒症心肌损伤[18]。本研究结果显示，益母草碱可上调冠心病大鼠心肌组织中GAS6蛋白表达和升高p-Axl/Axl比值；而加入GAS6/Axl信号通路抑制剂R428后，其可逆转高剂量益母草碱对冠心病大鼠心肌损伤的改善作用，进一步证实了益母草碱可通过激活GAS6/Axl信号通路减轻冠心病大鼠心肌损伤。

综上所述，益母草碱可减轻冠心病大鼠心肌损伤，其作用机制可能与激活GAS6/Axl信号通路相关，但其具体作用机制还需多方实验加以论证。