HPV E6/E7 mRNA 检测对 HPV16/18 DNA 阳性患者的分流价值

摘要：目的" 探讨HPV E6/E7 mRNA对HPV16/18 DNA阳性患者的分流价值。方法" 收集127例HPV16/18 DNA阳性的核酸样本，行HPV E6/E7 mRNA检测，并结合宫颈液基细胞学（TCT）结果和病理诊断结果进行统计分析。结果" ①HPV E6/E7 mRNA检出型别以单一感染为主，占比81.93%。年龄分布显示呈双峰状。②HPV E6/E7 mRNA总阳性率为65.35%，且随着宫颈病变程度升高，HPV E6 /E7 mRNA阳性率升高。且LSIL组与炎症组，HSIL+组与炎症组阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。③对HPV 16/18 DNA阳性者，用细胞学进一步分流，可以减少65.35%的阴道镜检查，漏诊44.83%的HSIL+；采用HPV E6/E7 mRNA进行分流，可以减少34.65%的阴道镜检查，漏诊10.34%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA分流漏诊率低于TCT分流方法，差异有统计学意义（P＜0.05）。④HPV16/18 DNA阳性且细胞学检查为≥ASC-US的患者，经HPV E6/E7 mRNA分流，可减少11.36%的阴道镜检查，无漏诊HSIL+。结论" HPV16/18 DNA阳性者进一步用TCT联合HPV E6/E7 mRNA进行同步分流，可以减少阴道镜检查，同时降低≥ASC-US的患者漏诊HSIL+的风险。

关键词：HPV E6/E7 mRNA；HPV；TCT；高级别鳞状上皮内瘤变

中图分类号：R737.33" " " " " " " " " " " " " " " " 文献标识码：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.18.010

文章编号：1006-1959（2024）18-0057-08

Abstract：Objective" To investigate the value of HPV E6/E7 mRNA in the shunt of HPV16/18 DNA positive patients.Methods" A total of 127 cases of HPV16/18 DNA positive nucleic acid samples were collected， and HPV E6/E7 mRNA was detected. The results were statistically analyzed in combination with the results of thinprepcytologic test （TCT） and pathological diagnosis.Results" ①The HPV E6/E7 mRNA was detected by mainly single infection， accounting for 81.93%. The age distribution showed a bimodal shape. ②The total positive rate of HPV E6/E7 mRNA was 65.35%. With the increase of cervical lesions， the positive rate of HPV E6/E7 mRNA increased， while the positive rate of LSIL group and inflammation group， HSIL+ group and inflammation group was statistically significant （Plt;0.05）. ③As the HPV 16/18 DNA positivity triage test， Cytology at the ASC-US+ threshold could reduce colposcopy by 65.35%， but missed diagnosis of HSIL+ by 44.83%; whereas HPVE6 /E7 mRNA could reduce the colposcopy by 34.65% ，and missed diagnosis of HSIL+ by 10.34%. As a triage test in HPV 16/18 DNA positivity patients， the missed diagnosis rate of HPV E6/E7 mRNA was lower than that of TCT （P＜0.05）. ④As a triage test， in patients with HPV16/18 DNA positive and cytological grades ≥ASC-US， E6/E7 mRNA could reduce the colposcopy by 11.36% and none missed diagnosis of HSIL+. Conclusion" TCT combined with HPV E6/E7 mRNA for synchronous shunt in HPV16/18 DNA positive patients can reduce colposcopy and the risk of missed diagnosis of HSIL+ in patients with ≥ASC-US.

Key words：HPV E6/E7 mRNA;HPV;TCT;High-grade squamous intraepithelial lesion

宫颈癌（cervical cancer）是女性常见的生殖道恶性肿瘤，2020年WHO颁布了《加速消除宫颈癌全球战略》，指出到2030年实现70%的女性在35岁和45岁之前进行高效宫颈癌筛查。2022年我国发布《宫颈癌筛查工作方案》，提出应创新宫颈癌筛查模式，提高筛查质量和效率，2025年底应实现宫颈癌筛查早诊率达到90%以上。近年来多项指南均推荐HPV检测作为初筛方法，HPV16/18阳性者转诊阴道镜，HPV其他高危型阳性进行细胞学分流[1-3]。但HPV DNA检测无法区分病毒的持续感染或一过性感染，易导致阴道镜过度转诊[4，5]；而宫颈液基细胞学（TCT）检测则存在诊断质量差异，漏诊率较高的问题[5，6]。研究发现[7-9]，HPV E6/E7 mRNA过表达是宫颈癌前病变的重要原因，检测HPV E6/E7 mRNA可以提高宫颈癌筛查特异度和阳性预测值。本研究对收集的HPV16/18 DNA阳性病例进行HPV E6/E7 mRNA检测，并将检测结果同TCT及病理诊断结果进行分析，探讨HPV E6/E7 mRNA对HPV16/18 DNA阳性患者的分流价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料" 收集广东省妇幼保健院127例HPV16/18 DNA阳性的核酸样本，其中单一HPV16型感染72例，单一HPV18型感染20例，HPV16+18型双重感染7例，HPV16+18型+HPV其他型别多重感染1例，HPV16型+HPV其他型多重感染19例，HPV18型+HPV其他型多重感染8例。患者年龄23～65岁，平均年龄（41.07±12.36）岁。病理诊断为炎症者62例，低度鳞状上皮内瘤变（LSIL）者36例，高度鳞状上皮内瘤变（HSIL）者26例，宫颈恶性肿瘤3例；TCT结果为未见上皮内病变细胞和恶性细胞（NILM）者83例，无明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）者18例，LSIL者12例，不能排除高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞（ASC-H）者3例，HSIL者11例。纳入标准：同时具有HPV DNA检测结果、TCT检查结果及病理诊断结果；核酸样本-60 ℃以下保存不超过6个月。排除标准：酸样本量不足以进行HPV E6/E7 mRNA检测。

1.2方法

1.2.1试剂及设备" HPV E6/E7 mRNA检测试剂由广州市宝创生物技术有限公司研发，设备为全自动医用PCR分析系统SLAN-96，由上海宏石医疗科技有限公司生产。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA检测" 取出各检测试剂，平衡至室温，待完全解冻后充分混匀各组分。取引物探针工作液2 μl、酶混合液4 μl、逆转录酶混合液1 μl、DEPC水8 μl，充分混匀后按15 μl/孔分装到PCR管中，加入5 μl核酸样本，盖紧PCR管盖，转移至SLAN-96荧光PCR仪中进行扩增。扩增程序为：55 ℃ 10 min，1个循环；95℃ 3 min，1个循环；95℃ 10 s、61 ℃ 35 s（收集信号）、69 ℃ 15 s，48个循环；95 ℃ 15 s、45 ℃ 20 s、35 ℃ 20 s、25 ℃ 30 s，1个循环；25 ℃逐渐升温至70 ℃，升温过程收集信号。检测完成后，分析HPV E6/E7 mRNA检测结果。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA分型" HPV E6/E7 mRNA检测试剂采用MPA（Multiplex Probe Amplification）技术实现一管内同时检测14种HPV E6/E7 mRNA。MPA技术核心是由不完全互补的寡核苷酸对组成，其中一条寡核苷酸（THO）与目的序列完全互补，并标记有荧光基团和淬灭基团，另一条寡核苷酸（PCO）与THO部分互补，THO与PCO组合形成特定Tm值的熔解峰，见图1[9]。当样本为阳性时，THO与目的序列杂交，被Taq酶剪切消耗，与PCO组合形成的熔解峰信号强度会减弱。而阴性质控无阳性模板，THO不会被消耗，可以与PCO组合形成较强信号的熔解峰。通过在特定Tm值范围内的阴性质控熔解峰与样本熔解峰的信号值差值来识别HPV E6/E7 mRNA阳性型别，见图2。PCO可以设计不同的长度和不同的错配碱基，与THO组合后可在同一个荧光通道形成5～6种不同Tm值的熔解峰，即一个荧光通道可实现5～6种分型，THO又可以标记不同的荧光基团，3个荧光通道（FAM./HEX/ROX）即可实现14种HPV E6/E7 mRNA的分型检测，见图3～图5。

1.3 统计学方法" 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料用（n）和（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 HPV E6/E7 mRNA检出率" 本研究检测试剂可对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14种型别的E6/E7 mRNA进行分型检测，除HPV45、59、66三种型别未检出外，其他型别均有检出，其中HPV16型检出最多，占比74.70%（62/83），其次是HPV18型，占比18.07%（15/83），见图6。83例HPV E6/E7 mRNA阳性样本中以单一感染为主，占比81.93%（68/83），其次是两重感染，占比13.25%（11/83），三重感染和四重感染也有检出，分别占比3.61%（3/83）和1.20%（1/83），见图7。

2.2不同年龄组HPV E6/E7 mRNA检出率比较" ＜30岁组、≥50岁组女性HPV E6/E7 mRNA阳性率均高于30～49岁年龄组女性，即呈现“双峰”模式，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3不同病理分级HPV E6/E7 mRNA阳性检出率比较" HPV E6/E7 mRNA总阳性率为65.35%（83/127），随着宫颈病变程度升高，HPV E6/E7 mRNA阳性率升高；LSIL组与炎症组的阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=6.63，P＜0.05）；HSIL+组与炎症组的阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=14.22，P＜0.05）；HSIL+组与LSIL组的阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=2.29，P＞0.05），见表2。

2.4 HPV16/18 DNA阳性者的TCT和HPV E6/E7 mRNA检测结果情况" HPV16/18 DNA阳性且TCT检查为NILM的患者中共39例HPV E6/E7 mRNA阴性，而HPV E6/E7 mRNA阴性者中仅有3例病理结果为HSIL+。HPV16/18 DNA阳性且TCT检查为ASC-US/LSIL组的患者中共5例HPV E6/E7 mRNA阴性，且5例HPV E6/E7 mRNA阴性病理检查均为炎症/LSIL。HPV16/18 DNA阳性且TCT检查为ASC-H/HSIL患者，HPV E6/E7 mRNA检测均为阳性，见表3。

2.5 HPV16/18 DNA阳性患者分流价值" 采用TCT对HPV16/18 DNA阳性者进一步分流，检查结果≥ASC-US判断为阳性，则阳性率为34.65%，即可以减少65.35%的阴道镜转诊，此时临床灵敏度为55.17%，即将会有44.83%的患者漏诊HSIL+。如选择HPV E6/E7 mRNA对HPV16/18 DNA阳性者进行分流，阳性率为65.35%，可以减少34.65%的阴道镜转诊，此时临床灵敏度为89.66%，漏诊率为10.34%。HPV E6/E7 mRNA分流漏诊率低于TCT分流方法，同时其阴道镜转诊可降低率也低于TCT分流方法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。HPV16/18 DNA阳性患者若同时采用TCT和HPV E6/E7 mRNA进行分流，TCT检查为NILM组HPV E6/E7 mRNA阳性率为53.01%，可减少46.99%的阴道镜转诊，此时临床灵敏度为76.92%，漏诊率为23.08%。当TCT检查为≥ASC-US时，HPV E6/E7 mRNA阳性率为88.64%，可减少11.36%的阴道镜转诊，此时临床灵敏度为100.00%，无漏诊HSIL+的患者。采用HPV E6/E7 mRNA对HPV16/18 DNA阳性且TCT为NILM组的患者进一步分流，阴道镜转诊可降低率高于HPV16/18 阳性且TCT≥ASC-US组，但其漏诊率也高，见表5。

3讨论

高危型HPV持续感染是引发宫颈癌的根本原因。研究表明[10]，超过99%的宫颈癌前病变和宫颈癌是由高危型HPV感染引起的，其中HPV16/18型占70%左右。HPV病毒是双链环状DNA病毒，分为3个功能区，其E区编码的E6、E7蛋白为其主要的致癌蛋白，可与宿主细胞的抑癌蛋白p53和pRB结合，使宿主细胞无限分裂不凋亡，进而引发癌变。

HPV感染存在自限性，大约67%的HPV感染在1年内被机体清除，超过90%的感染在2年内清除[10]。一过性感染阶段，HPV病毒的DNA进入宿主细胞，处于游离状态，不表达或低表达E6/E7 mRNA，一般不导致细胞恶性改变；当高危型HPV持续感染，HPV DNA和人类基因组DNA发生整合，E6/E7 mRNA大量表达，进而引发宿主细胞恶性改变，直至癌变[11]。有研究显示[12，13]，与HPV DNA相比，检测HPV E6/E7 mRNA可以降低不必要的诊疗，节省筛查成本，使患者获益。2019年美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP）发布的宫颈癌筛查指南中也支持使用更高特异性的检测方法，其中包括HPV E6/E7 mRNA[2]。

不同型别HPV致癌风险存在差异，对HPV进行分型检测更具诊断价值。有文献报道[11]，HPV16、18、31、33和45中E6/E7癌蛋白的表达是导致宫颈癌前病变和宫颈癌的主要原因。本研究在127例HPV 16/18 DNA阳性的核酸样本中共检出HPV E6/E7 mRNA阳性83例，其中HPV16型占比74.70%（62/83），HPV18型占比18.07%（15/83），与文献报道的阳性型别检出趋势一致[14]。进一步分析发现HPV E6/E7 mRNA阳性样本以单一感染为主，占比81.93%（68/83），其次是双重感染，占比13.25%（11/83），三重感染和四重感染分别占3.61%（3/83）和1.20%（1/83）。目前大多数文献并未对HPV E6/E7 mRNA进行分型检测[15，16]，本研究的分型检测有利于深入探讨不同型别HPV E6/E7的致病风险和临床价值，但由于本研究中多重感染病例数较少，故未对多重感染的意义进一步讨论。本研究结果发现，当宫颈病变由炎症逐渐升级为LSIL、HSIL+时，HPV E6/E7 mRNA检出率由48.39%逐渐提高至75.00%、89.66%，即HPV E6/E7 mRNA的阳性率随着宫颈病变加重而升高。2019年一项研究显示[17]，HPV E6/E7 mRNA在炎症组、LSIL、HSIL+组的阳性率依次为44.52%、69.66%和90.14%，本研究结果与之相近。且本研究显示，HPV E6/E7 mRNA与宫颈病变的病理分级相关，HPV DNA检测仅证实了病毒的存在，而HPV E6/E7 mRNA则显示了致癌基因转录活性的增加，从而增加了该检测的预后价值，可以更好的评估宫颈病变风险。

目前指南推荐的宫颈癌筛查方案，对于初筛HPV16/18 阳性者，即使TCT检查呈阴性，也建议行阴道镜检查[1-3]。但这其中包含了部分一过性的HPV16、18型感染，造成资源浪费[11]。有研究发现[18]，HPV16 DNA阳性且TCT阴性的患者发生HSIL+病变的风险为9.5%，HPV18 DNA阳性且TCT阴性的患者发生HSIL+病变的风险为5.9%。这些研究提示，HPV16/18 DNA阳性直接转诊阴道镜，可能会导致过度诊疗，增加患者的经济和心理负担。鉴于此，针对HPV16/18 DNA阳性的患者，有必要进一步分流管理。本研究对HPV16/18型DNA阳性患者分别采用TCT和HPV E6/E7 mRNA进行分流，结果显示TCT分流可以减少65.35%的阴道镜转诊，但同时会漏诊44.83%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA分流可以减少34.65%的阴道镜转诊，漏诊10.34%的HSIL+，提示HPV16/18型DNA阳性患者采用TCT或HPV E6/E7 mRNA方法进行分流，都可以减少阴道镜转诊，但同时也都会存在一定比例的HSIL+漏诊。国外有研究发现[19]，HPV DNA阳性患者采用HPV E6/E7 mRNA分流可以减少63%的阴道镜转诊，漏诊率为32%。其结果与本研究结果存在差异，可能的原因为本研究入组的样本为HPV16/18型DNA阳性，未包含HPV其他型阳性的样本。

为进一步探讨HPV E6/E7 mRNA的诊断分流价值，本研究同时采用HPV E6/E7 mRNA和TCT对HPV16/18 DNA阳性者进行分流，结果显示HPV E6/E7 mRNA对NILM组分流可以减少46.99%的阴道镜转诊，但漏检23.08%的HSIL+；HPV E6/E7 mRNA对≥ASC-US组分流可以减少11.36%的阴道镜转诊，且无漏检HSIL+，表明HPV16/18 DNA阳性患者同时采用TCT≥ASC-US和HPV E6/E7 mRNA进行分流，既可以减少阴道镜转诊，又降低宫颈HSIL+的漏诊率，提升筛查的阳性预测值。王富伟等[20]也对HPV16/18 DNA阳性患者进一步分流，发现HPV E6/E7 mRNA对ASC-US/LSIL组分流可以减少34.1%的阴道镜转诊，但漏检14.8%的HSIL+，与本研究结果略有差异，分析原因可能是不同研究间的TCT检查灵敏度存在差异。TCT检测易受采样、制片及医生诊断水平等因素的干扰，不同研究之间TCT灵敏度存在差异。另有研究发现[21]，HPV16/18型DNA阳性且TCT检查为NILM的患者，HPV E6/E7 mRNA分流后阳性预测值由21.62%提升至了40.54%，同样支持HPV E6/E7 mRNA对HPV16/18型DNA阳性患者的分流价值。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA检测方法的特异性高于HPV DNA，可以用于HPV16/18型DNA阳性患者的分流，以减少不必要的阴道镜检查。HPV16/18 DNA阳性者用TCT联合HPV E6/E7 mRNA进行分流，可以减少阴道镜检查，同时降低≥ASC-US的患者漏诊HSIL+的风险。

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收稿日期：2023-09-18；修回日期：2023-09-26

编辑/杜帆

基金项目：广东省中医药局科研项目（编号：20221043）

作者简介：王意（1979.9-），女，河北保定人，硕士，副主任医师，主要从事宫颈癌及癌前病变的筛查与防治、阴道镜规范化检查与质控的研究