基于荧光探针技术检测粮油储运中的赭曲霉毒素A

摘 要：为实现粮油储运中真菌毒素的快速检测，本文建立基于荧光探针技术检测赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的荧光传感方法。通过制备硫化铜纳米颗粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）以及在CuS NPs上修饰OTA单体克隆抗体（Antibody，Ab）形成硫化铜纳米颗粒-OTA单克隆抗体免疫信号标记物（CuS-Ab NPs）进行荧光检测，采用外标法定量。结果显示，OTA浓度在0.1～200.0 ng·mL-1线性关系良好，方法检出限为0.01 ng·mL-1，加标回收率为93.89%～109.96%，相对标准偏差为2.37%～5.12%。该方法检测灵敏度及准确性高、特异性好，适用于粮油储运中OTA的检测。

关键词：荧光探针技术；赭曲霉毒素A（OTA）；加标回收率

Detection of Ochratoxin A in Grain and Oil Storage and Transportation Based on Fluorescence Probe Technology

DU Ruiting

（Hohhot Grain and Oil Quality Testing Center， Hohhot 010070， China）

Abstract： In order to realize the rapid detection of mycotoxins in grain and oil storage and transportation， a fluorescence sensing method based on fluorescence probe technology was established to detect ochratoxin A （OTA）. Copper sulfide nanoparticles （CuS NPs） were prepared and OTA monoclonal antibody （Ab） was modified on CuS NPs to form copper sulfide nanoparticles-OTA monoclonal antibody immune signal marker （CuS-Ab NPs） for fluorescence detection， and external standard method was used for quantification. The results showed that the linear relationship of OTA concentration was good in the range of 0.1 ng·mL-1 to 200.0 ng·mL-1， the detection limit of the method was 0.01 ng·mL-1， the recovery rate was 93.89% to 109.96%， and the relative standard deviation was 2.37% to 5.12%. This method has high sensitivity， accuracy and specificity， and is suitable for OTA detection in grain and oil storage and transportation.

Keywords： fluorescent probe technology; ochratoxin A （OTA）; spiked recovery rate

近年来，随着经济的快速发展以及生活水平的提高，人们对粮油质量的关注度日益增加[1]。绿色、无毒无害的食品不仅能够满足人们日常所需的营养膳食，且不会对人体造成任何伤害。然而，在粮油储运过程中，食品易受到真菌毒素、杀虫剂等物质的污染，对人们健康造成严重威胁[2]。因此，有必要采取有效的技术手段对粮油质量进行检测，从而确保粮油安全。粮油中最具代表性的毒素包括赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）、伏马毒素（Fumonisin，FB1）、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）及黄曲霉毒素（Aflatoxin B1，AFB1）和T-2毒素等[3]。有研究发现，OTA与动物的肾毒性相关，并有可能造成动物肝脏受损[4]，对人体健康产生极大威胁。目前，针对粮油中真菌毒素检测常用的技术手段包括色谱分析、传感器以及免疫分析[5]等。其中，基于荧光探针的检测技术具有灵敏度高、快速、样品消耗低等优点，但该方法在检测OTA的应用研究中鲜少报道。基于此，本文建立基于荧光探针技术检测粮油储运中OTA的方法，以实现真菌毒素的快速、高效检测。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

玉米、咖啡和大豆，购自某大型超市。

巯基乙酸，阿拉丁试剂有限公司；氯化铜，国药集团化学试剂有限公司；NaOH、浓硫酸，天津市风船化学试剂科技有限公司；硫代乙酰胺，天津博迪化工股份有限公司；戊二醛50%，天津市大茂化学试剂厂；2-吗啉乙磺酸，天津渤化化学试剂有限公司；N-N二甲基甲酰胺，北京金泰宏达生物科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺、牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司。上述所有试剂均为分析纯。

标准品OTA（1 mg·mL-1）、ZEN（1 mg·mL-1）、FB1（5 mg·mL-1）、DON（5 mg·mL-1）、AFB1（10 mg·mL-1）和T-2毒素（10 mg·mL-1），北京坛墨质检科技有限公司；OTA单克隆抗体（5 mg·mL-1）、抗原（4 mg·mL-1），山东绿都科技有限公司。实验中所用水均为超纯水。

1.2 实验仪器

S210 pH计、AL240电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MK3酶标仪、F1微量移液器、Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔公司；DHG-9245A恒温培养箱，上海恒科仪器有限公司；F97Pro荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司；Mili-Q纯水系统，美国Millipore公司；LS13320激光粒度，美国贝克曼库尔特公司；JEM-2100F扫描电镜、D/max 2500 X射线衍射仪，日本理学株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米颗粒及免疫信号标记物的制备

（1）硫化铜纳米颗粒（Copper Sulfide Nanoparticles，CuS NPs）的制备。在100 mL超纯水中加入1.705 g CuCl2·2H2O和13.85 mL巯基乙酸，混合搅拌30 min，加入浓度为20 mg·mL-1的NaOH溶液，使溶液的pH值达到9.0。然后，加入0.751 g硫代乙酰胺，在50 ℃条件下反应6 h并通入N2，以充分去除氧气。最后用超滤离心管离心洗涤3次，并将其分散于超纯水中，制备得到CuS NPs。

（2）硫化铜纳米颗粒-OTA单克隆抗体免疫信号标记物（CuS-Ab NPs）的制备。分别取100 μL浓度为32 mg·mL-1的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为20 mg·mL-1的N-N二甲基甲酰胺（用2-吗啉乙磺酸缓冲液配制，pH=5.5）溶液，与1 mL CuS NPs悬浮液混合，活化CuS NPs表面的羧基，在25 ℃条件下反应2 h，离心后去除上清液，再将1 mL浓度为220 μg·mL-1的OTA单克隆抗体加入其中，于4 ℃下振荡孵育12 h，离心。最后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，制备得到CuS-Ab NPs。

1.3.2 定量检测方法及标准曲线的绘制

①对黑色聚苯乙烯微孔板的表面用200 μL浓度为2.5%的戊二醛（PBS缓冲液溶解）氨基活化2 h，之后使用PBS洗涤3次；②在活化后的微孔板上加入50 μL浓度为30 μg·mL-1的OTA抗原，37 ℃孵育2 h以固定OTA抗原，用PBS缓冲液洗涤3次后，再加入120 μL浓度为5%的牛血清白蛋白溶液，再次用PBS缓冲液洗涤3次；③将50 μL浓度为0.7 mg·mL-1的CuS-Ab NPs和不同浓度的OTA加入到固定有OTA抗原的微孔板中，37 ℃反应60 min，并用PBS缓冲液洗涤3次；④为溶解CuS-Ab NPs免疫标记物的Cu2+，将200 μL浓度为0.1 mol·L-1的盐酸溶液加入到微孔板中，于37 ℃下振荡反应30 min；⑤加入5 μL浓度为0.5 mg·mL-1的铜离子荧光探针继续振荡45 min，进行荧光检测。实验中，用PBS缓冲液将OTA的标准品稀释为不同浓度梯度（0.1 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1）的OTA，并依据相应的荧光强度来绘制标准曲线。

1.3.3 特异性实验

在检测中可能存在被多种真菌毒素污染的现象，因此选取AFB1、DON、ZEN、FB1以及T-2毒素等干扰物质进行特异性实验。这些毒素与OTA单克隆抗体相结合时，会发生假阳性。在实验中，选取OTA浓度为1 ng·mL-1，其他毒素浓度为10 ng·mL-1，进行3次平行实验。

1.3.4 样品前处理方法

分别称取1 g大豆面、玉米面和咖啡面置于5 mL离心管中，加入2 mL浓度为10 ng·mL-1的OTA标准液，漩涡振荡5 min，然后在转速为10 000 r·min-1条件下离心15 min，取上清液，并过0.45 μm微滤膜，最后用PBS缓冲液稀释。

2 结果与分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 CuS-Ab NPs浓度的优化

通过研究不同浓度CuS-Ab NPs对应荧光强度的变化，可知CuS-Ab NPs浓度为0.5～0.7 mg·mL-1时，其对应的荧光强度随CuS-Ab NPs浓度的增大而增强；当浓度在0.7～0.9 mg·mL-1时，其对应的荧光强度基本不变。因此，选择CuS-Ab NPs浓度为0.7 mg·mL-1进行后续实验。

2.1.2 OTA抗原浓度的优化

通过研究不同OTA抗原浓度下荧光强度的变化，可知OTA抗原浓度为10～30 μg·mL-1时，荧光强度随OTA抗原浓度的增加而增强；当OTA抗原浓度为30～50 μg·mL-1时，荧光强度保持不变。因此，选择OTA抗原浓度为30 μg·mL-1进行后续实验。

2.1.3 反应时间的优化

通过研究不同反应时间对荧光强度的影响，可知在20～60 min，Cu2+探针发生开环导致水解反应产物逐渐增多，且荧光强度增大；当反应时间超过60 min后，CuS-Ab NPs和OTA抗原的浓度、荧光强度均降低。因此，选择反应时间为60 min进行后续实验。

2.2 标准曲线的绘制

按照1.3.2项所示方法，进行荧光检测，发现目标产物在495 nm激发光极下发出508～650 nm的发射光，且与荧光强度成正比，荧光强度在554 nm处达到峰值。因此，选取在554 nm荧光强度下对OTA进行定量检测，结果如图1所示。以OTA浓度为横坐标，以其对应的荧光强度为纵坐标，建立标准曲线，线性方程为y=-5.211x+8 426，相关系数为R2=0.693 8，表明OTA浓度在0.1～200.0 ng·mL-1线性关系良好。

2.3 检出限

以3倍信噪比（S/N=3）对应的浓度为检出限，计算得到检出限为0.01 ng·mL-1，表明该方法能够实现对粮油样品中OTA的快速检测，且灵敏度高。

2.4 特异性实验

为验证基于荧光探针检测粮油中毒素OTA的特异性，选取1.3.3项中提到的5种毒素作为干扰物质，测定结果如图2所示。图2中，纵坐标为空白对照组（F0）/实验组（F）。当只加入OTA时，F0/F值最大；当加入5种干扰物时，F0/F值较小且相差较小，表明干扰物质不能与OTA结合。结果表明，OTA和抗体间具有高结合作用，特异性良好。

2.5 加标回收实验

选取被OTA污染的玉米、大豆和咖啡按照本研究中建立的方法进行检测，以研究基于荧光探针技术对粮油中真菌毒素检测的适用性。同时，采用传统的酶联免疫吸附方法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）进行对比，结果如表1所示。

由表1可知，在0.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的加标水平下，按照ELISA法测定不同样品中OTA的加标回收率为88.36%～109.00%，而按照本研究中建立方法所测定的结果为93.89%～109.96%；ELISA方法计算得到相对标准偏差为3.35%～6.32%，而基于本研究中建立方法的结果为2.37%～5.12%。对比可知，两种方法结果基本保持一致，表明基于荧光探针技术对粮油中OTA含量的检测结果准确性较高。

3 结论

本文建立了一种基于荧光探针技术检测OTA的荧光传感方法。结果表明，OTA浓度在0.1～200 ng·mL-1线性关系良好，方法检出限为0.01 ng·mL-1，加标回收率为93.89%～109.96%，相对标准偏差为2.37%～5.12%。该方法检测灵敏度及准确性高、特异性好，适用于粮油储运中OTA的检测。

参考文献

[1]李群，牛瀚璐，张胜男.气相色谱技术在粮油食品质量检测中的应用[J].中国食品工业，2024（12）：103-105.

[2]宗振，孙森森，陈晨.粮油检验在粮油储存安全中的重要性探索[J].山西农经，2021（10）：176-177.

[3]李文廷，叶沛，刘玲，等.粮食作物中真菌毒素脱毒技术及其防控措施研究进展[J].粮食与油脂，2024，37（9）：1-7.

[4]杜瑞亭.动态微波辅助技术在粮食真菌毒素和农药残留识别中的应用[J].现代食品，2024，30（12）：170-172.

[5]黄力，杨静，李滑滑.不同前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1检测效果对比[J].中国粮油学报，2022，37（1）：182-186.