miR-204和SIRT1在结直肠癌中的表达情况及临床意义

[摘要]"目的"探讨miR-204和沉默信息调节因子1（silence"information"regulator"1，SIRT1）在结直肠癌组织中的表达情况及其临床价值。方法"收集2018年5月至2020年6月嘉兴大学附属医院胃肠外科诊治的60例结直肠癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本为研究对象，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-204及SIRT1的基因表达情况，Pearson分析比较miR-204与SIRT1基因的表达相关性。采用免疫组织化学SABC法检测SIRT1蛋白表达，并比较不同SIRT1蛋白表达与临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析不同SIRT1蛋白表达的结直肠癌患者的生存差异。结果"癌组织中miR-204基因mRNA表达显著低于癌旁组织（Plt;0.05），SIRT1基因mRNA表达显著高于癌旁组织（Plt;0.05）。癌组织中SIRT1蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织（Plt;0.05）。Pearson相关分析显示miR-204与SIRT1基因mRNA在癌旁组织和癌组织中的表达均呈负相关（r=–0.647、–0.737，Plt;0.05）。SIRT1蛋白的表达与结直肠癌的分化水平、浸润层次、淋巴结转移与否及TNM分期相关（Plt;0.05），与患者的年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤部位无关（Pgt;0.05）。Kaplan-Meier分析显示癌组织中SIRT1阳性表达患者的生存率显著低于SIRT1阴性表达患者（χ2=5.001，P=0.025）。结论"结直肠癌组织中miR-204表达下调，SIRT1表达上调，二者可能通过相互影响共同促进结直肠癌的转移、侵袭，并影响患者预后。

[关键词]"结直肠癌；miR-204；沉默信息调节因子1；基因表达

[中图分类号]"R735.3""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.22.014

Expression"of"miR-204"and"SIRT1"in"colorectal"cancer"and"their"clinical"significance

HUANG"Liyong，"WU"Jiaming，"PENG"Yuping，"LI"Jin，"CHEN"Zhiheng

Department"of"Gastrointestinal"Surgery，"Affiliated"Hospital"of"Jiaxing"University，"Jiaxing"314000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"expression"of"miR-204"and"silence"information"regulator"1"（SIRT1）"in"colorectal"cancer"and"their"clinical"value."Methods"Cancer"tissue"specimens"and"paracancer"tissue"specimens"of"60"patients"with"colorectal"cancer"treated"in"Department"of"Gastrointestinal"Surgery"of"Affiliated"Hospital"of"Jiaxing"University"from"May"2018"to"June"2020"were"collected"as"study"objects."Real"time"fluorogenic"quantitative"polymerase"chain"reaction"was"used"to"detect"the"gene"expression"of"miR-204"and"SIRT1，"and"the"correlation"between"miR-204"and"SIRT1"gene"expression"was"compared"by"Pearson"analysis."Immunohistochemical"SABC"method"was"used"to"detect"SIRT1"protein"expression，"and"relationship"between"different"SIRT1"protein"expression"and"clinicopathological"features"was"compared."Kaplan-Meier"method"was"used"to"analyze"the"survival"difference"of"colorectal"cancer"patients"with"different"SIRT1"protein"expression."Results"The"mRNA"expression"of"miR-204"gene"in"cancer"tissues"was"significantly"lower"than"that"in"paracancer"tissues"（Plt;0.05），"and"the"mRNA"expression"of"SIRT1"gene"was"significantly"higher"than"thatnbsp;in"paracancer"tissues"（Plt;0.05）."Pearson"correlation"analysis"showed"that"miR-204"was"negatively"correlated"with"SIRT1"mRNA"expression"in"both"paracancer"tissues"and"cancer"tissues"（r=–0.647，"–0.737，"Plt;0.05）."The"expression"of"SIRT1"protein"was"correlated"with"the"differentiation"level，"invasion"level，"lymph"node"metastasis"and"TNM"stage"of"colorectal"cancer"（Plt;0.05），"but"not"with"patient"age，"gender，"tumor"size"and"tumor"site"（Pgt;0.05）."Kaplan-Meier"analysis"showed"that"the"survival"rate"of"patients"with"positive"expression"of"SIRT1"in"cancer"tissues"was"significantly"lower"than"that"of"patients"with"negative"expression"of"SIRT1"（χ2=5.001，"P=0.025）."Conclusion"The"expression"of"miR-204"is"down-regulated"and"SIRT1"expression"is"up-regulated"in"colorectal"cancer"tissues，"which"may"jointly"promote"the"metastasis"and"invasion"of"colorectal"cancer"and"affect"the"prognosis"of"patients"through"mutual"influence.

[Key"words]"Colorectal"cancer;"miR-204;"Silence"information"regulator"1;"Gene"expression

中国的结直肠癌发病率居高不下，严重影响国人的生命健康。微RNA（microRNA，miRNA）是一种真核生物的内源性小分子单链非编码RNA，可作为癌基因或抑癌基因参与恶性肿瘤的发生与演化[1]。miR-204基因是由约20个碱基合成的单链RNA，定位于染色体9q21，是一种重要的肿瘤调控基因，并在多种人类恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭等多种生物学行为相关。沉默信息调节因子1（silence"information"regulator"1，SIRT1）是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide"adenine"dinucleotide，NAD）的组蛋白去乙酰化酶，与肿瘤细胞的增殖、分化和迁移相关。目前miR-204和SIRT1在结直肠癌组织标本中的表达差异、两者表达的相关性及对患者预后的影响尚未见明确报道。本研究拟通过对人结直肠癌新鲜冰冻组织中miR-204和SIRT1进行提取和检测，并与入组患者的临床资料及预后进行分析，探讨两者在结直肠癌诊治中的应用价值。

1""资料与方法

1.1""资料收集

收集2018年5月至2020年6月嘉兴大学附属医院胃肠外科诊治的60例结直肠癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本为研究对象。纳入标准：①组织病理学符合《中国结直肠癌诊疗规范（2017年版）》[2]标准；②未行术前放化疗及靶向治疗；③患者或其授权人知情并同意本研究。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②合并炎症性肠病等自身免疫性肠道疾病者；③有严重脏器功能障碍及感染性疾病无法耐受手术者。本研究经嘉兴大学附属医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：2024-LY-028）。

1.2""miR-204和SIRT1基因mRNA表达检测

收集新鲜结直肠癌组织和癌旁组织标本（距肿瘤边缘5cm）迅速置于冻存管中并投入液氮或–80℃冰箱中保存待测。提取总RNA纯化并定量，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real"time"fluorogenic"quantitative"polymerase"chain"reaction，RT-PCR）检测miR-204和SIRT1基因mRNA表达，检测仪器为美国ABI公司7500型RT-PCR，引物序列见表1。反应体系共20µl（F-Primer"0.8μl；R-Primer"0.8μl；ROX"Reference"Dye"Ⅱ"0.4μl；SYBR"Premix"Ex"TaqⅡ"10μl；RNase-free"water"6μl；cDNA"2μl），反应条件设置：预变性95℃，2min；变性94℃，15s；退火55℃，15s；延伸72℃，30s。以U6作为内参，重复3个复孔，共38个循环。采用2-∆∆Ct方法（Ct值为循环阈值）计算miR-204和SIRT1基因mRNA相对表达量。

1.3""免疫组织化学反应

结直肠癌组织和癌旁组织样本经固定、脱水、石蜡包埋后进行连续切片，免疫组织化学法（SABC法）检测SIRT1表达情况，PBS代替一抗作为阴性对照。SIRT1蛋白主要表达于细胞核，阳性呈棕黄色。在高倍镜视野下随机选取5个视野，按每张切片中阳性细胞的百分比和着色深浅计分行半定量分析（取两项评分之和作为总积分）：0～3分为阴性（–），≥4分为阳性（+）。以上结果判断均在双盲法下进行。

1.4""临床资料收集及随访

收集入选患者的一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤大小和部位、组织学分级、癌浸润层次、淋巴结转移与否、TNM分期等。所有结直肠癌患者术后常规每3个月电话或门诊随访1次，随访内容包括：患者后续诊治情况、生存质量及复发死亡情况。随访时间截至2023年3月。

1.5""统计学方法

数据处理和分析采用SPSS"25.0软件包。其中计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用Mann-Whitney"U检验；相关性采用Pearson相关性分析；预后分析采用Kaplan-Meier法。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""结直肠癌组织及癌旁组织中miR-204和SIRT1表达差异

RT-PCR结果显示，癌组织中miR-204基因mRNA表达显著低于癌旁组织（Plt;0.05），SIRT1基因mRNA表达显著高于癌旁组织（Plt;0.05）。免疫组织化学结果显示，癌组织中SIRT1蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织（Plt;0.05），见表2、图1。

2.2""miR-204与SIRT1基因mRNA表达的相关性

miR-204与SIRT1基因mRNA在癌旁组织和癌组织中的表达均呈负相关（r=–0.647、–0.737，Plt;0.05），见图2。

2.3""结直肠癌组织中SIRT1蛋白表达与临床病理特征的关系

不同性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤部位的结直

肠癌患者，其SIRT1蛋白表达无差异（Pgt;0.05）。对分期晚、淋巴结阳性、浸润层次深及组织分化差的患者，其癌组织中SIRT1阳性表达比例较高（Plt;0.05），见表3。

2.4""结直肠癌组织SIRT1蛋白表达与患者生存情况的关系

随访13～56个月，中位随访时间32个月，癌组织中SIRT1阳性表达患者的生存率（22/39，56.4%）显著低于SIRT1阴性表达患者（18/21，85.7%）（χ2=5.001，P=0.025），见图3。

3""讨论

结直肠癌的发生发展与基因突变密切相关，已有多种基因标志物广泛用于肿瘤诊断、评估及预后判断。研究发现miRNA可与其调控的下游靶基因的非翻译区结合，形成RNA沉默诱导复合体促进靶基因的裂解或阻断其蛋白翻译等途径影响靶基因的表达[3-4]。miR-204作为miRNA家族成员之一，已有研究指出其异常表达与食管癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌及霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤的发生发展相关[5-11]。Shen等[6]研究指出，miR-204-5p在食管癌细胞中低表达，可通过酪氨酸3单加氧酶/色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径参与食管癌细胞的增殖、侵袭和转移过程。在人胃癌细胞中miR-204也呈低表达，过表达miR-204可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭从而起到抗肿瘤作用，同时低表达miR-204可激发胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗疗效[7-8]。本研究结果显示，结直肠癌组织中miR-204亦为低表达，可能作为抑癌基因参与结直肠癌的发生发展。

SIRT1是依赖于NAD+的脱乙酰化酶，既往对其研究多集中在脑组织损伤、脓毒症及炎症性脏器损伤[12]。近年来，SIRT1在恶性肿瘤中的异常表达成为研究热点。有学者发现SIRT1可在人体多个癌细胞株中异常表达，可通过调控上皮间质转化（epithelial-"mesenchymal"transition，EMT）参与肿瘤细胞的增殖和侵袭[13-14]。Zhang等[15]指出SIRT1在胃癌组织中表达上调，在体外细胞实验中发现SIRT1缺失可通过激活信号转导及转录激活蛋白3/基质金属蛋白酶13信号通路促进胃癌进展，提示SIRT1具有肿瘤抑制作用。而Özcan等[16]研究发现SIRT1在胃癌组织中高表达，其在随访结果中指出SIRT1基因上调与患者的不良预后相关。Han等[17]研究指出无脑转移的非小细胞肺癌（non-small"cell"lung"cancer，NSCLC）中SIRT1的表达水平明显低于合并脑转移的NSCLC，推断其可能作为肿瘤转移的潜在标志物参与NSCLC的进展。以上研究对SIRT1参与癌症的角色并未统一，SIRT1是癌基因还是抑癌基因尚存在争议。本研究显示结直肠癌组织中SIRT1蛋白及mRNA均高表达，同时SIRT1蛋白的表达情况与肿瘤分期、淋巴结是否阳性、浸润深度及组织分化情况相关。此外，生存分析发现SIRT1高表达者预后更差，提示SIRT1可能作为致癌基因参与结直肠癌患者的肿瘤侵袭、转移进程，并不利于患者预后。

通过检索文献及对SIRT1的上游miRcode基因预测发现，miR-204是调控SIRT1表达的重要基因[18]。Zhang等[19]通过萤光素酶报告指出在胃癌细胞中miR-204可通过下调SIRT1表达进而影响多种EMT相关分子的表达（如E钙黏蛋白、N钙黏蛋白等），从而抑制胃癌细胞的侵袭转移，发挥其抗肿瘤效应。Shu等[20]发现miR-204可抑制靶基因SIRT1的表达促进P53乙酰化，从而增强多柔比星对前列腺癌的化疗敏感度。本研究运用RT-PCR方法检测新鲜冰冻癌组织及癌旁组织中miR-204及SIRT1的相对表达量，并进行Pearson相关性分析，结果提示两者之间存在显著的负相关，提示miR-204和SIRT1在结直肠癌中通过相互影响共同推动肿瘤的进展。研究表明miR-204和SIRT1的不同表达均可使其癌细胞对铂类及氟尿嘧啶类化疗药物的敏感度出现差异[21-22]，而铂类和氟尿嘧啶类药物是结直肠癌内科化疗的主要用药，鉴于两者之间存在负相关，推断影响化疗敏感度的因素主要与SIRT1相关，后期可在细胞学研究中通过调控miR-204影响SIRT1蛋白的表达水平，进一步观察结直肠癌细胞对铂类或氟尿嘧啶类药物的敏感度差异，指导临床患者的化疗方案选择。

综上，miR-204可能作为抑癌基因参与结直肠癌的发生，通过对其下游靶基因SIRT1的调控影响肿瘤分化、侵袭和转移，进而影响患者的预后。miR-204和SIRT1均有望成为预测结直肠癌术后铂类及氟尿嘧啶类化疗药物敏感度的新靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–02–26）

（修回日期：2024–06–26）