多指标响应面-满意度函数优化秦岭龙胆提取工艺研究

摘要 ［目的］优化秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的共提取条件。［方法］在单因素试验基础上选取最佳因素水平，采用响应面-满意度函数优选料液比、提取时间、超声频率对龙胆苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影响。［结果］秦岭龙胆中2个成分的共提最优条件为提取时间26 min、料液比1∶21（g：mL）、超声频率58 kHz，在此条件下，龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分别为0.312%、0.258%，分别与预测值（0.326%、0.270%）接近。［结论］响应面-满意度函数可用于秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取工艺的优化，该方法快速、简单、稳定可行。

关键词 秦岭龙胆；龙胆苦苷；獐牙菜苦苷；响应面法；满意度函数；共提取条件

中图分类号 R 284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）23-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.035

Study on Optimization of Extraction Process from Gentiana apiata by Multi-index Response Surface-satisfaction Function

XU Hai-yan1，HOU Min-na1，CHEN Yan-bin2 et al

（1.Medical College，Shaanxi Institute of International Trade，Xianyang，Shaanxi 712046;2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi’an，Shaanxi 710075）

Abstract ［Objective］ To optimize the co-extraction conditions of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata.［Method］On the basis of single factor experiments，the optimal factor level was selected，and the response surface-satisfaction function was used to optimize the effects of solid-liquid ratio，extraction time and ultrasound frequency on the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin.［Result］The optimal conditions for co-extraction of two components from Gentiana apiata in Qinling Mountains were extraction time of 26 minutes，solid-liquid ratio of 1∶21 （g∶mL），and ultrasonic frequency of 58 kHz.Under these conditions，the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin were 0.312% and 0.258%，respectively，which were close to the predicted values of 0.326% and 0.270%，respectively.［Conclusion］The response surface satisfaction function can be used to optimize the co-extraction process of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata in Qinling Mountains.This method is fast，simple，stable and feasible.

Key words Gentiana apiata;Gentiopicroside;Swertiamarin;Response surface methodology;Satisfaction function;Co-extraction condition

基金项目 陕西省教育厅青年创新团队建设科研计划项目（21JP011）；陕西省科技厅项目（2021SF-365）；国家大学生创新创业项目（S202113123008）。

作者简介 许海燕（1977—），女，陕西咸阳人，副教授，硕士，从事天然产物化学研究。*通信作者，主任药师，硕士生导师，从事药物分析研究。

收稿日期 2023-12-14；修回日期 2024-01-30

秦岭龙胆（Gentiana apiata）别名茱苓草、太白龙胆，属龙胆科龙胆属植物，秦巴山区特有药用资源，生长于高山草甸中，夏、秋花期采收，民间以全草入药，主要用于头晕失眠、月经不调、小便不利等病症［1-2］。有研究表明秦岭龙胆中含有萜类、酚酸类、挥发油类、皂苷类、糖类等成分［3-4］。其中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷属萜类中的环烯醚萜苷类化合物，为秦岭龙胆中的主要化学成分，药理试验表明，该类成分具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、保肝、神经保护等作用［5-6］。查阅国内外相关文献发现，对于秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷提取方面的研究鲜见报道，而且目前对于中药的提取工艺研究多以单一化合物为指标，少有多指标联用考察提取工艺，这就增加了提取时溶剂、时间等能耗的浪费，不利于提取过程中绿色节能环保。因此，笔者以秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的提取率为共提取评价指标，采用响应面-满意度函数优化提取工艺，确定最佳工艺参数，建立共提取方法，以期为秦岭龙胆的提取及进一步发展提供参考依据，也为其他中药材提取过程中的节能绿色环保提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试材 秦岭龙胆药材购自陕西省眉县药材公司，经陕西中医药大学杨新杰教授鉴定为秦岭龙胆（Gentiana apiata N.E.Brown）的干燥带花全草。

1.2 主要仪器与试剂 电子天平（京制00000246）；数控超声波清洗器（KQ5200DE）；高效液相色谱仪（Waters e2695）。 龙胆苦苷标准品（PS010423）、獐牙菜苦苷标准品（PS012298），对照品纯度均不低于98.5%；甲醇（色谱纯）；磷酸、无水乙醇、甲醇，均为分析纯。

1.3 龙胆苦苷、獐牙菜苦苷含量测定

1.3.1 药材预处理。

将秦岭龙胆药材处理干净，放置烘箱 （60 ℃） 中干燥，再用粉碎机进行粉碎，粉碎完成后过筛 （80目） ，置于密封袋中备用。

1.3.2 色谱条件。

色谱柱为Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.2% 磷酸溶液，B为10%甲醇溶液。洗脱采用梯度洗脱，各流动相的比例分别为0～10 min，A（90% → 72%）、B（10% → 28%）；10 ～ 30 min，A（72% → 71%）、B（28% → 29%）。流速1 mL/min；波长254 nm；进样量10 μL［7］。

1.3.3 标准曲线的绘制。

精密量取适量的龙胆苦苷和獐牙菜苦苷对照品，纯甲醇溶解后浓度分别为0.130和0.265 mg/mL的混合对照品溶液。移取混合对照品溶液1、3、5、7、9、11 mL，纯甲醇稀释10倍，以“1.3.2”色谱条件进样，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 龙胆苦苷（獐牙菜苦苷）提取率的测定。

精密称取适量处理干净的药材粉末，采用超声法提取，甲醇为溶剂，过滤，滤液按“1.3.2”色谱条件分别测定秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷含量，按以下公式计算二者的提取率。

提取率=提取液中龙胆苦苷（獐牙菜苦苷）含量秦岭龙胆质量× 100%

1.4 单因素试验 该试验使用超声辅助提取法，以甲醇为提取溶剂，采用控制单一变量法，在保证其他条件不变的情况下，分别考察料液比、提取时间、超声频率3个因素对同时提取秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影响。

1.5 满意度函数

满意度函数用于优化多种目标成分，可将多响应值的优化转变为单响应值的优化，将不同的响应值转化为0～1的无量纲数值，数值趋近于1时的效果最好［8-9］。该试验选择龙胆苦苷提取率和獐牙菜苦苷提取率作为2个不同响应值，通过优化料液比、提取时间、超声功率3个单一因素以获得总体满意度值，旨为找到适合的优化提取工艺条件。满意度函数如下：

Di（Yi）=0Yi（x）≤Yimin

Yi（x）-YiminYimax-YiminYimin<Yi（x）≤Yimax

1Yi（x）>Yimax

D=d1w1×d2w2×d3w3×…×diwi

式中：Di（Yi）为总体满意度；Yi（x）为响应值；Yimin为最小响应值；Yimax为最大响应值。wi表示各响应值权重，各响应值权重之和为1，即w1＋w2＋…+wi=1［10］，该研究中只涉及2个因素，故只有2个权重，即w1（龙胆苦苷权重）和w2（獐牙菜苦苷权重），由于这2个成分均为药材中的主要活性成分，故设定w1、w2均为0.5。

1.6 响应面分析

以单因素试验结果为依据，结合Box-Behnken法，设定料液比（A）、提取时间（B）、超声频率（C）3个影响因素，利用响应面软件对龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取条件进行优化，得到二者的提取率，将二者提取率利用满意度函数转化为共提取总体满意度，再以总体满意度为响应值，分析数据结果，得到共提取最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 色谱峰的建立

供试品与对照品溶液分别按照“1.3.2”色谱条件进样，测定结果如图1所示，HPLC图基线平稳，样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷与其他峰分离情况较好，保留时间分别为16.168、14.889 min，与对照品的保留时间（16.096和14.843 min）分别仅相差0.072和0.046 min。

2.2 标准曲线绘制

2.2.1 龙胆苦苷标准曲线。从龙胆苦苷标准曲线（图2）可以看出，龙胆苦苷浓度为0.13 ～1.46 mg/mL时线性关系良好，回归方程为y=1 322 116.81x+7 114.05（R2=0.999 8）。

2.2.2 獐牙菜苦苷标准曲线。

从獐牙菜苦苷标准曲线（图3）可以看出，獐牙菜苦苷浓度为0.26 ～2.88 mg/mL时线性关系良好，回归方程为y=642 755x+9 181.8（R2=0.999 2）。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间对龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影响。

设定料液比1∶10（g∶mL）、超声频率100 kHz，考察不同提取时间（5、10、15、20、25、30 min）对秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影响。从图4a可以看出，提取时间25 min之前龙胆苦苷和獐芽菜苦苷的提取率升高明显，随后提取率略有下降，可能是25 min左右时药材内外活性成分浓度达到平衡，随着时间延长活性成分被破坏或者发生了变化，故选择25 min为最佳提取时间。

2.3.2 料液比对龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影响。

固定超声频率100 kHz、提取时间25 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）对秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐芽菜苦苷提取率的影响。从图4b可以看出，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的提取率随着溶液体积的增加也逐渐增高，1∶20的料液比后提取率增加不太明显，可能此料液比时龙胆苦苷和獐牙菜苦苷被溶解完全，故选择1∶20作为最佳料液比。

2.3.3 超声频率对龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影响。

在料液比1∶20、提取时间25 min条件下，考察不同超声频率（50、60、70、80、90、100 kHz）对秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影响。从图4c可以看出，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的提取率与超声频率呈相关性，随着超声频率的增加而增大， 提取率在70 kHz时达到峰值，而后下降，超声频率太高，可能有效成分被破坏，故最佳超声频率选择70 kHz。

2.4 响应面-满意度函数优化分析

根据上述单因素试验的结果，以响应面软件对共提取工艺条件进行优化。以料液比（A）、提取时间（B）、超声频率（C）为自变量，以总体满意度（D）为响应值，试验设计方案与结果见表1。

利用Design-Expert 8.0.5 b软件对秦岭龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷共提取工艺优化条件进行分析，以2种成分的提取率总体满意度（D）为响应值，得到二次多项回归方程为

D=-12.897 71+0.691 08A+0.297 88B+0.050 56C+6.07×10-4AB+1.78×10-5AC - 1.71×10-4BC-0.013 59A2-7.048 90×10-3B2-3.770 76×10-3C2

对满意度进行回归方差分析，结果表明（表2），模型及失拟项的P值分别为0.000 4和0.267 1，说明模型显著而失拟项不显著，模型拟合度高，得到的二次回归方程预测性较佳。此外，从表3中可直观看出，各影响因素一次项P值均小于0.05，说明各因素对秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的提取率影响均显著。各交互项的P值均大于0.05，说明各因素之间互相没有影响。

调整确定系数R2adj=0.907 9，表明90.79%的响应值可用该模型解释。从一次项P值结合F值来看，各因素影响满意度的次序为C>A>B。

从3个影响因素两两交互作用的响应面与等高线图（图5）可以看出，各因素的最佳范围分别为提取时间（A）24～28 min、料液比（B）1∶19～1∶23、超声频率（C）55～70 kHz。等高线图显示，C的曲面较A和B曲面陡峭，而A的曲面较B陡峭，说明C对提取率的影响强于A，而A强于B［11］，此分析与表3结果吻合。

通过Design-Expert 8.0.5 b软件对试验结果进行分析，得到最优工艺为提取时间25.77 min、料液比1∶21.32、超声频率57.53 kHz，在此工艺下，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的提取率分别为0.326%、0.270%，总体满意度为0.847 6。为了试验的可操作性，修正秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取条件为提取时间26 min、料液比1∶21、超声频率58 kHz，经过3次重复性试验，得到此工艺下龙胆苦苷和獐牙菜苦苷平均提取率分别为0.312%和0.258%，比预测值分别相差0.014百分点、0.012百分点，总体满意度为0.810 6，与预测者仅相差0.037。各试验值与模拟值接近，表明该模型拟合度较高，可用于秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取预测。

3 结论

超声提取法是利用超声波的空化作用，将植物中的化学成分快速提取出来的方法，相比较传统的提取方法其具有提取温度低、时间短、提取效率高等特点，目前常用于中药材的提取［12］。甲醇作为一种亲脂亲水性溶剂，可将植物中绝大多数活性成分提取出来，常作为提取溶剂使用。龙胆苦苷和獐牙菜苦苷为秦岭龙胆中的活性成分，其药理活性已得到证实，如具有治疗肝脏疾病、代谢、抗炎镇痛等方面作用，在临床上应用也较为广泛［13］。查阅文献发现，对于药材中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的提取都是将其中一种成分进行提取，少有同时将2种成分同时提取出来，且提取率也不是特别高。因此，该研究以秦岭龙胆作为研究对象，以甲醇作为提取溶剂，采用超声辅助提取法，考察提取时间、料液比、超声频率对秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影响，并采用响应面-满意度函数对提取工艺进行

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优化，得到的最优工艺条件为提取时间26 min、料液比1∶21（g∶mL）、超声频率58 kHz，在此条件下龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分别为0.312%、0.258%，分别与预测值（0.326%、0.270%）接近。表明响应面-满意度函数可用于秦岭龙胆中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷共提取工艺的优化，该方法快速、简单、稳定可行。该研究结果可为其他中药中化学成分的共提取工艺研究提供参考依据。

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