鸡蛋源纳米硫化亚铁的合成及其对尖孢镰刀菌引起的囊肿的治疗作用

摘要 在对1例犬右肺囊肿伴肝淤血和胃肠臌气诊治的基础上，分离鉴定出1株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），同时合成和探究鸡蛋源纳米硫化铁对尖孢镰刀菌引起的犬囊肿的治疗效果。通过病原学诊断、病史调查、临床表现、血液学生理生化指标检查、X线检查等方法诊断该病为尖孢镰刀菌引起的多器官囊肿。通过正交试验合成了抗真菌的鸡蛋源纳米硫化亚铁，并将其应用于抑制尖孢镰刀菌生长。结果表明：根据诊断结果采用对因治疗（鸡蛋源纳米硫化亚铁抗尖孢镰刀菌）和对症治疗（高压氧舱吸氧、肝肺和胃肠穿刺），达到了抗尖孢镰刀菌引起的囊肿的治疗效果。

关键词 鸡蛋源纳米硫化亚铁；囊肿；尖孢镰刀菌

中图分类号 S 859.79 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）23-0075-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.017

Synthesis of Egg White-derived Nano-ferrous Sulfide and Its Therapeutic Effect on Cysts Caused by Fusarium oxysporum

LENG Chang-you1， CHEN Le2， WU Hao-dong2 et al

（1.Chongqing Rongchang District Vocational Education Center，Chongqing 402460;2. Animal Medical College of Southwest University， Chongqing 402460 ）

Abstract Based on the diagnosis and treatment of a canine right lung cyst with liver congestion and gastrointestinal gas， a strain of Fusarium oxysporum was isolated and identified. At the same time， the therapeutic effect of egg white-derived nano-iron sulfide on canine cysts caused by Fusarium oxysporum was synthesized and explored. The disease was diagnosed as multiple organ cysts caused by Fusarium oxysporum by etiological diagnosis， medical history investigation， clinical manifestations， hematological physiological and biochemical index examination， X-ray examination and other methods. Antifungal egg white-derived nano-iron sulfide was synthesized by orthogonal test and applied to inhibit the growth of Fusarium oxysporum. The results showed that according to the diagnosis results， the therapeutic effect of anti-F.oxysporum cysts was achieved by treatment （egg white source nano-ferrous sulfide anti-F.oxysporum） and symptomatic treatment （hyperbaric oxygen chamber oxygen inhalation， liver and lung and gastrointestinal puncture）.

Key words Nano-iron sulfide from egg;Cyst;Fusarium oxysporum

基金项目 重庆市教委重大基金资助项目（KJZD-M202200202）；中国农村专业技术协会重庆荣昌肉兔科技小院项目。

作者简介 冷长友（1972—），男，重庆人，高级讲师，从事临床兽医学研究。

收稿日期 2024-01-03

尖孢镰刀菌是常见的腐生霉菌［1］，特别是在炎热的夏季，尖孢镰刀菌易大量滋生，动物吸入了空气中的尖孢镰刀菌孢子出现呼吸道感染［2］。尖孢镰刀菌会导致食物迅速腐败、发酵。动物采食了被污染的食物或者霉烂变质食物引起胃肠道异常发酵，产生大量气体而不能及时排出，而在腹部大量集聚，动物出现食欲下降、腹部胀大、腹部皮肤绷紧如鼓的症状［3］，并压迫附近的肝脏等器官导致淤血，治疗不及时容易出现死亡等预后不良的表现。

环境中的病原微生物（如尖孢镰刀菌等）易导致肺炎，而且肺炎是临床上动物常见的多发病、常见病，肺炎的临床表现主要有湿性或者干性咳嗽、流浓鼻涕、呼吸困难和肺气肿等症状［4］。肺炎如果没有得到及时治疗，会伴发或继发其他病症（如缺氧、胃扩张、肺泡及肺间质气肿，对机体导致严重损伤［5］等）而造成病情加重［6］，该病往往发病急，如不及时救治会导致动物死亡。因此在对症治疗时，往往要求迅速、准确地诊断出危害动物健康的因素，采取穿刺放气、吸氧等方法抢救动物生命，降低气体、血液等不利因素对心、肺、肝等重要器官的损伤。

该病的病原菌为侵袭性尖孢镰刀菌，采用常用抗生素（如酮康唑、伊曲康唑等）方法防治真菌感染。但目前大多数有效的抗侵袭性尖孢镰刀菌的药物只能在人医上使用，而且国家批准的动物用抗真菌药物很少。因此，开发新的动物用抗真菌剂是十分必要的。疾病的治疗原则包括对因治疗和对症治疗。随着机械工业化的发展，大量蛋类产品被生产出来供给人类的各种需要，但在生产、运输过程中鸡蛋容易受损，出现残次鸡蛋。鸡蛋是一种极好的天然蛋白质来源，也是一种被忽视的天然生物材料。此外，纳米硫化物还具有低细胞毒性和生物相容性等显著优势，将有机硫化合物转化为纳米级无机硫化物可以通过热溶剂法实现。有研究表明，纳米级金属硫化物表现出很高的抗菌活性［7-8］。

笔者对炎热夏季尖孢镰刀菌大量繁殖导致的动物右肺囊肿伴肝淤血和胃肠臌气的疾病模型进行诊治，并通过形态学和分子生物学方法鉴定和鉴别了侵袭性致病真菌为尖孢镰刀菌。同时，通过正交试验优化了合成方法，合成了一种新型抗真菌剂（鸡蛋源纳米硫化亚铁）。在体外抗真菌试验中，确定了鸡蛋源纳米硫化亚铁抑制侵袭性尖孢镰刀菌的抑菌作用。通过动物回归试验，验证了鸡蛋源纳米硫化亚铁对镰刀霉菌引起的肺囊肿的治疗作用，发现使用残次等级的鸡蛋可以生产出高价值的抗真菌药物鸡蛋源纳米硫化亚铁，这为工业化次等级蛋产品的利用拓展了一条新的途径，为开发动物用新型纳米抗真菌剂提供了科学依据，也希望能对临床上该类真菌疾病的诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株的来源

4月龄大的拉布拉多犬和主人居住在低楼层，经常吃剩菜。疾病刚开始时病犬经常咳嗽流鼻涕，打鼾不严重，鼻塞，偶尔会呕吐。考虑到该犬在发病初期和晚期都不想进食，且该犬的精神状态较正常，该犬主人予以阿莫西林进行治疗。饲喂阿莫西林后病情无好转。7 d后病犬出现心脏突然跳动，呼吸系统纤维支气管镜有明显湿啰音（气泡破裂），全身不适，食欲不振等临床症状，就诊检查发现，犬体温39.8 ℃，心跳89次/min，最大摄氧量96次/min。该犬的皮肤和黏膜颜色较浅。尿液颜色正常。因此，送医并采集胃内容物培养，并进行形态学和分子生物学鉴定。

1.2 鸡蛋源纳米硫化亚铁的合成

通过正交试验筛选鸡蛋源纳米硫化亚铁的最佳合成方法，正交试验采用3因素3水平方法（表1）。通过热溶剂法合成鸡蛋源纳米硫化亚铁，取乙酸钠、无机硫（硫酸亚铁）后，按表1设计正交试验。反应结束后，12 000 r/min，离心5 min后取上清。

1.3 主要试剂

DNA基因组提取试剂盒、DNase I、qPCR试剂盒、Trizol试剂盒购于TaKaRa 公司；引物、2×Taq PCR Master Mix和DL 2 000 DNA Marker购于北京擎科生物科技有限公司；反转录试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；噻唑蓝购于Sigma公司。

1.4 主要仪器

微量核酸检测仪（NanoDrop 2 000）；荧光倒置显微镜（Leica）；荧光定量PCR仪（QuantStudio6）；酶标仪（Thermo）。

2 结果与分析

2.1 病原学检查

2.1.1 病原菌的形态学鉴定。

将胃内容物接种到沙氏培养基中，25 ℃恒温培养7 d。菌丝长出后，将菌丝体接种到新的沙氏培养基上，直至培养基上长出纯培养物。能够观察到培养基正面的菌落呈粉红色或红色，培养基背面皱纹发黄，菌落边缘呈圆形，菌丝呈絮状密集生长。显微镜下可见带侧枝的气生菌丝；形成的分生孢子呈镰刀状，末端尖细，略弯曲，分生孢子大小为（10～16）μm×（4～2）μm。培养后期出现厚垣孢子，菌丝部位膨起，光学显微镜下发现带侧枝的气生菌丝，分生孢子呈镰刀状，如图1所示。根据该病原菌的形态特征，可初步判断为尖孢镰刀菌。

2.1.2 致病菌确定。

用真菌DNA提取试剂盒提取DNA后，使用ITS1和ITS4引物进行扩增，引物序列为（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）。配制25 μL的PCR反应体系：1.0 μL DNA模板；上、下游引物各1.0 μL；12.5 μL 2×PCR mix；9.5 μL ddH2O。扩增程序：预变性，94 ℃反应5 min；变性，94 ℃反应30 s；退火，55 ℃反应30 s；延伸，72 ℃反应1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存产物。选择2%琼脂糖凝胶进行电泳，得到长度约560 bp的片段，如图2所示。将所得数据在NCBI库进行BLAST比对，发现OBfKYhJTOb1e2ddYUNkRKw==该菌与尖孢镰刀菌ITS序列的同源性达到99%～100%。

2.2 侵袭性尖孢镰刀菌对血液生理指标的影响

d+SOlqJcg4IbACZ5ST5iJA==

血常规检查见白细胞数总数为31.8×109个/L（正常参考范围6.0～17.0×109个/L），淋巴细胞数为7.4×109个/L（正常参考范围0.8×109～5.1×109个/L），单核细胞数为1.9×109个/L（正常参考范围0～1.8×109 /L），红细胞数为3.77×1012个/L（正常参考范围5.50～8.50×109个/L），血红蛋白浓度为83 g/L（正常参考范围110～190 g/L），红细胞压积为25.5％（正常参考范围39.0%～56.0%），其他未见异常，提示机体存在严重感染与严重贫血现象。

2.3 侵袭性尖孢镰刀菌对血液生化指标的影响

血液中C-反应蛋白浓度为58.8 μg/L（正常参考范围0～10 μg/L），提示机体存在严重炎性反应；丙氨酸氨基转移酶浓度为97 U/L（正常参考范围17～78 U/L），提示肝脏损伤，肝细胞中有肝脏酶露出现象。

2.4 气性囊肿对内脏器官（胃、肠、肝、肺）形态的影响

治疗前，X射线检查见胸腔内右背侧中后缘处有一规则的圆形低密度阴影，形成占位性的含气结构影像（图3A、图3B的a箭头部位），穿刺和抗菌治疗7 d胸腔右背侧的圆形低密度阴影体积缩小（图3C的a箭头部位），在治疗第14天（图3D的a箭头部位）时胸腔右背侧的圆形低密度阴影体积进一步缩小，直至第21天检查时痊愈（图3E）。治疗前，肝脏体积增大，在腹腔右侧形成椭圆形低密度阴影（图3A、图3B的b处箭头部位），穿刺和抗菌治疗7 d明显缩小（图3C的b箭头处），进而在治疗的第14天痊愈（图3D的b箭头处）。治疗前，胃及肠道内充满大量气体（图3A、图3B的c箭头部位），在腹腔形成胃肠扩张的影像，治疗7 d后胃肠体积缩小（图3C和图3D的c箭头部位）。

综上，根据动物临床表现、病原学的形态学和分子生物学诊断、血液生理指标、血液生化指标和X线检查等结果进行综合分析，最终诊断该病为尖孢镰刀菌引起的右肺囊肿伴肝脏淤血和胃肠臌气。

2.5 肺脏和胃肠紧急穿刺放气治疗

穿刺之前X光发现动物呼吸困难，肺脏有气肿（图4中a箭头）、肝脏淤血（图4中b箭头）和胃肠臌气（图4中c箭头），遂对右肺气性囊肿和胃肠臌气分别进行细针穿刺抽吸气体，发现右肺穿刺手术结束后动物呼吸窘迫现象得到明显缓解，肺脏的气肿泡明显缩小（图4B的a箭头）。呼吸次数从99次/min恢复到63次/min，接近正常呼吸频率范围。胃穿刺放气手术结束后腹围扩大现象降低，胃肠扩张程度明显降低（图4C），右肺的圆形低密度阴影范围明显降低，肝脏的淤血症状得到了缓解（图4A和4B的b箭头）。

2.6 采用吸氧方法缓解气体囊肿压迫淤血导致的缺氧

穿刺治疗后将动物每天放进高压氧舱2 h，其中吸氧时间为1 h，使动物处于高浓度（80%）的氧气环境，以提高动物的血氧含量直到呼吸异常症状恢复，吸氧治疗7 d后动物动脉血氧饱和度（SaO2）恢复正常，动物的动脉血氧饱和度平均达到94％。

2.7 鸡蛋源纳米硫化亚铁的合成和对侵袭性尖孢镰刀菌IC50的测定

通过正交试验筛选鸡蛋源纳米硫化亚铁的最佳合成方法。通过热溶剂法合成鸡蛋源纳米硫化亚铁，取乙酸钠、无机硫（硫酸亚铁）后，按表1所示正交试验设计进行不同反应条件下的合成。反应结束后，12 000 r/min离心5 min后取上清，用噻唑蓝染色法测定尖孢镰刀菌在鸡蛋源纳米硫化亚铁处理4 h后的死亡率，以筛选合成鸡蛋源纳米硫化亚铁的最佳条件。即在噻唑蓝染色后，使用酶标仪读取OD570 nm，以DMSO作为对照，绘制拟合曲线并计算IC50。

正交试验结果显示，使用以下配方（硫酸亚铁、乙酸钠、鸡蛋2.5 g加蒸馏水定容至20 mL）在100 ℃反应釜中反应48 h合成的鸡蛋源纳米硫化亚铁表现出最好的抑菌效果。尖孢镰刀菌在被鸡蛋源纳米硫化亚铁处理4 h后，使用噻唑蓝染色后发现，鸡蛋源纳米硫化亚铁质量浓度越高，尖孢镰刀菌的死亡率越高。尖孢镰刀菌死亡率和鸡蛋源纳米硫化亚铁浓度的相关性拟合曲线如图5所示，其对数函数为Y=13.643+18.138lnX（R2=0.985 4），IC50为0.886 g/L（95%置信区间0.847 8～0.924 4 g/L）。

2.8 鸡蛋源纳米硫化亚铁对侵袭性尖孢镰刀菌的抑制作用

针对侵袭性真菌尖孢镰刀菌，使用上述自主合成的新型抗真菌药物鸡蛋源纳米硫化亚铁进行治疗。使用0.886 g/L口服20 mL，每日1次，口服治疗后第7天动物精神状态、食欲、呼吸等外观体征基本恢复正常；再次进行X线检查，见右肺气性囊肿体积明显缩小，胃与肠道位置恢复正常（图4C），肺脏体积明显变小（图3E）。另外，采集胃内容物进行培养后，采用形态学和分子生物学方法鉴定，均证明尖孢镰刀菌阴性。

3 结论与讨论

在疾病治疗时，紧急症状容易危及动物生命，因此在治疗时需要针对紧急症状进行紧急治疗。由于发生了肺叶气性囊肿、胃扩张及其导致的急性肝淤血3种紧急病症，易因呼吸困难和缺氧而致动物死亡，因此首先需要对动物的胃及肺囊肿进行细针穿刺抽吸手术，穿JgQqPH9xYRGCgCRFuvcE+g==刺抽吸手术极大地缓解了缺氧的症状，为后续的诊断和治疗争取了宝贵的时间。但是在穿刺抽吸手术时，应根据动物的大小掌握穿刺的位置以及进针的角度与深度，另外穿刺较小的动物时要选择较细的穿刺针，尽量减少对肺组织和胃肠组织的过度损伤。在肺部穿刺时，确认穿刺针进入肺部而不是胸腔，防止气体进入胸膜腔而失去负压造成医源性气胸［9］。

气性囊肿（又称肺叶气性囊肿）的特征为肺叶上出现圆形低密度阴影，是由于肺炎或吼叫等不良因素引起临近肺泡及肺间质破损后形成的气性囊腔结构［10］。X线检查对肺气囊肿的诊断比较确切，在X线片中病变区域一般呈规则的低密度阴影影像，X线机设备价格不高，普通的动物医院均可配备，因此临床中对肺叶气性囊肿的诊断可以借助X线机检查来实现。

吸氧不仅可以改善机体内组织的血氧含量，对于有肺泡及肺间质结构损伤的肺部疾病，吸氧还可以减少肺能量的消化，进而促进肺组织的结构修复［11］。在肺叶气性囊肿穿刺前动物表现呼吸急促，穿刺后将其放入氧舱装置内进行吸氧治疗，治疗2 d后对其进行X线检查，发现肺叶气性囊肿大小恢复到与穿刺前一样，且动物并未再表现出呼吸急促的症状，该现象表明，肺叶气性囊肿能否引起呼吸异常主要取决于机体内组织的血氧含量。

急性肝淤血（又称为被动性肝充血）时，X线检查显示肝脏明显增大，这可能是由于胸腔和腹腔内气体蓄积过多导致肝静脉血管狭窄，肝脏中的血液回流不畅［12］，以致肝小叶内中央静脉和肝血窦被动性充血，从而出现动物肝淤血，表现为动物肝脏体积增大，肝静脉内压力过度升高而疼痛的症状。因此，对于急性肝淤血的紧急症状，随着细针穿刺抽吸手术的实施，肝血管的通畅性得以改善，血液循环障碍消失，肝脏体积逐渐恢复正常。

该研究提供了一种动物用的抗真菌剂，硫酸亚铁、乙酸钠、鸡蛋2.5 g加蒸馏水定容至20 mL在100 ℃反应釜中反应48 h合成的鸡蛋源纳米硫化亚铁表现出最好的抗尖孢镰刀菌效果。尖孢镰刀菌是广泛存在于温暖潮湿地区的腐生型致病真菌，伴随黄曲霉菌及其他致病菌导致多种动物发病。动物通过吸入空气中的霉菌孢子出现呼吸道感染，或者动物采食了被尖孢镰刀菌污染的食物引起动物胃肠道异常发酵出现胃肠臌气的现象，而使用该抗菌剂联合对症治疗可以有效治疗侵袭性真菌引起的气性囊肿。

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