miR-625-5p靶向LASP1对结直肠癌细胞增殖、迁移、凋亡的作用

[摘要]"目的"探究微小RNA-625-5p（miR-625-5p）是否可靶向LIM和SH3结构域蛋白1（LIM"and"SH3"protein"1，LASP1）影响结直肠癌（colorectal"cancer，CRC）细胞的增殖、迁移及凋亡。方法"CRC细胞转染后分为空白对照组、阴性对照组、miR-625-5p类似物组、miR-625-5p"抑制剂组、miR-625-5p类似物+LASP1组。进行荧光定量聚合酶链式反应（quantitative"polymerase"chain"reaction，qPCR）检测各组LASP1、miR-625-5p的mRNA表达，双荧光素酶报告基因检测基因靶向结合关系，细胞计数试剂盒（cell"counting"kit，CCK）-8检测细胞活性，细胞平板克隆检测细胞克隆能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell法检测细胞迁移及侵袭，EDU实验测定细胞增殖，蛋白免疫印迹（Western"blot）法检测LASP1及侵袭转移相关蛋白神经型钙黏蛋白（neural"cadherin，N-cadherin）和上皮型钙黏蛋白（epithelial"cadherin，E-cadherin）的表达情况。结果"qPCR检测证明细胞转染成功，双荧光素酶报告基因检测到miR-625-5p可靶向结合LASP1。与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组的细胞活性和细胞克隆、迁移、侵袭、增殖数量及LASP1、N-cadherin表达水平降低（Plt;0.05），细胞凋亡率及E-cadherin表达水平上升（Plt;0.05），miR-625-5p抑制组上述指标的结果完全相反。与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组的细胞活性和细胞克隆、迁移、侵袭、增殖数量及LASP1蛋白表达水平升高（Plt;0.05），细胞凋亡率降低（Plt;0.01）。结论"miR-625-5p可靶向LASP1抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移，并促进凋亡。

[关键词]"miR-625-5p；LIM和SH3结构域蛋白1；结直肠癌

[中图分类号]"R735.3""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.003

miR-625-5p"targets"LASP1"to"inhibit"the"proliferation"and"migration"of"colorectal"cancer"cells"and"promote"apoptosis

XU"Yiping1，"ZHANG"Tingting1，"SHANG"Tao2

1.Department"of"Pathology，"Hangzhou"Cancer"Hospital，"Hangzhou"310005，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Anorectal"Diseases，"the"First"Affiliated"Hospital"of"Zhejiang"Chinese"Medicial"University，"Hangzhou"310018，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"whether"miR-625-5p"can"target"LIM"and"SH3"protein"1"（LASP1）"to"affect"the"proliferation，"migration"and"apoptosis"of"colorectal"cancer"cells."Methods"Colorectal"cancer"（CRC）"cells"were"transfected"into"control"group，"NC"group，"miR-625-5p"mimic"group，"miR-625-5p"inhibitor"group"and"miR-625-5p"mimic+LASP1"group."Quantitative"polymerase"chain"reaction"（qPCR）"assay"was"performed"to"detect"mRNA"expression"of"LASP1"and"miR-625-5p"in"each"group，"dual-luciferase"reporter"gene"was"used"to"detect"gene"targeting"binding"relationship，"cell"activity"was"detected"by"cell"counting"kit"（CCK）-8，"cell"cloning"ability"was"detected"by"cell"plate"cloning，"cell"apoptosis"was"detected"by"flow"cytometry，"and"cell"migration"and"invasion"were"detected"by"Transwell"assay."Cell"proliferation"was"measured"by"EDU"assay，"and"expression"of"LASP1"and"invasion"and"metastasis"related"proteins"neural"cadherin"（N-cadherin）"and"epithelial"cadherin"（E-cadherin）"were"detected"by"Western"blot."Results"qPCR"experiment"proved"that"cell"transfection"was"successful."The"dual"luciferase"reporter"gene"detected"that"miR-625-5p"could"target"LASP1."Compared"with"NC"group，"cell"activity，"cell"cloning，"migration，"invasion，"proliferation"and"protein"expression"levels"of"LASP1"and"N-cadherin"in"miR-625-5p"mimic"group"were"significantly"decreased"（Plt;0.05）."Apoptosis"rate"and"E-cadherin"protein"expression"level"were"significantly"increased"（Plt;0.05），"but"expression"of"above"indicators"was"completely"opposite"in"miR-625-5p"inhibitor"group."Compared"with"miR-625-5p"mimic+LASP1"group，"cell"activity，"cell"cloning，"migration，"invasion，"proliferation"and"LASP1"protein"expression"level"were"significantly"increased"（Plt;0.05），"and"cell"apoptosis"rate"was"significantly"decreased"（Plt;0.01）."Conclusion"miR-625-5p"can"target"LASP1"to"inhibit"the"proliferation"and"migration"of"CRC"and"promote"apoptosis.

[Key"words]"miR-625-5p;"LIM"and"SH3"protein"1;"Colorectal"cancer

结直肠癌（colorectal"cancer，CRC）是一种起源于结肠或直肠的胃肠道恶性肿瘤，早期治疗以手术结合辅助治疗为主[1]。近年来，靶向疗法已广泛应用于肿瘤的临床治疗，但由于高耐药和高转移使得已有的靶向治疗效果仍不理想，因此开发寻找新的作用靶点，探究其作用机制迫在眉睫[2-3]。

研究表明LINC01123是一种由c-Myc激活的长链非编码RNA，在结直肠癌细胞系敲降LINC01123可抑制结直肠癌细胞的增殖能力和迁移能力[4]。微小RNA-625-5p（miR-625-5p）可与LINC01123形成竞争性内源RNA（competing"endogenous"RNAs，ceRNA）机制，参与黑色素瘤的糖酵解过程[5]。由此推测，LINC01123通过结合miR-625-5p在结直肠癌中发挥分子海绵作用影响结直肠癌的增殖及转移过程。研究表明高表达LINC01123可通过调节miR-625-5p/LASP1轴在CRC进展中发挥其致癌作用。LIM和SH3结构域蛋白1（LIM"and"SH3"protein"1，LASP1）高表达于结直肠癌患者的组织标本中，细胞实验显示LASP1可促进结直肠癌细胞的增殖迁移[6-7]。本研究旨在探讨miR-625-5p是否可靶向LASP1影响结直肠癌的细胞进程。

1""材料与方法

1.1""实验材料与设备

LOVO人结肠癌细胞购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。DMEM培养基购自Hyclone公司。EDU-594细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。反转录试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司。细胞计数试剂盒（cell"counting"kit，CCK）-8试剂盒购自MCE公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。细胞凋亡试剂盒、基底膜基质胶购自美国BD公司。LASP1抗体、神经型钙黏蛋白（neural"cadherin，N-cadherin）抗体、上皮型钙黏素（epithelial"cadherin，E-cadherin）抗体、GAPDH"抗体购自美国Affinity公司。AE2000型光学显微镜（Motic公司），Ts2-FC型倒置荧光显微镜（日本尼康公司）。实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative"polymerase"chain"reaction，qPCR）（美国Bio"Rad公司），Nanodrop"one型mRNA定量仪（美国Thermo"Scientific公司），C6型流式细胞仪（美国BD公司）。EPS300型电泳仪、VE"180C型电泳槽、VE186型转膜仪（天能集团）。610020-9Q型化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司公司）。

1.2""实验方法

LOVO细胞在DMEM培养基中生长，培养基含有10%胎牛血清和1%青霉素，环境条件为37℃、5%CO2的培养箱。细胞分为空白对照组：不做转染；阴性对照组：LOVO细胞转染miR-NC；miR-625-5p"类似物组：LOVO细胞转染miR-625-5p"类似物；miR-625-5p抑制剂组：转染miR-625-5p"抑制剂；miR-625-5p"类似物+LASP1组：转染miR-625-5p"类似物和过表达LASP1。取对数生长期细胞，接种于12孔板中，每孔1×105个细胞，加入miR-625-5p类似物和miR-625-5p抑制剂孵育并按照分组要求进行细胞转染，24h后进行观察，待转染效率达到70%时进行实验处理。取1×107个细胞并加入1000µl"Trizol到匀浆管以提取RNA，后在42℃、15min和85℃、5min条件下进行反转录反应，进行PCR反应见表1引物序列，检测LOVO细胞中LASP1、miR-625-5p"mRNA表达情况。

分别构建LASP1-3'UTR"WT和LASP1-3'UTR"MUT，细胞铺板16h后转染荧光素酶报告质粒和miR-34c类似物，每个样品设置3个复孔，转染6h后更换新鲜完全培养基。转染48h后，进行Luciferase活性检测。将转染48h后的LOVO细胞以1×104个细胞/孔加入10μl"CCK-8。通过检测450nm"处的吸光度监测细胞活力。将转染后的细胞用胰酶消化，按每孔500～1000个细胞接种于6孔板进行培养，37°C和5%"CO2下孵育14d后进行拍照观察并统计细胞克隆数量。取对数生长期细胞种植于6孔板，2ml/孔工作体积，细胞接种密度为1.2×106个细胞/孔，PBS润洗后调整细胞浓度为1×106个/ml，加入5μl"Annexin"V-FITC与10μl"PI避光孵育15min，加入结合缓冲液上流式细胞仪检测细胞凋亡率。DMEM高糖培养液按3：1比例稀释基质胶，取30μl基质胶稀释液，包被Transwell小室，4℃孵育。细胞按上述分组处理24h后，Transwell小室放入24孔培养板，上室加入细胞，培养24h，固定，PBS润洗，0.1%结晶紫染液染色30"min后拍照并计数。取细胞进行细胞爬片，贴壁后加入EDU工作液孵育，孵育结束后固定。再次加入0.5ml点击反应液避光孵育，PBS润洗后封片拍照观察。将各组细胞用RIPA裂解缓冲液提取蛋白质样品，然后用12%"SDS/PAGE处理并电泳转移到PVDF膜上，加入一抗山羊抗兔IgG二抗避光孵育，之后进行ECL化学发光仪显影。检测LASP1及侵袭转移相关神经型钙黏蛋白（neuro"cadherin，N-cadherin）和上皮型钙黏蛋白（epithelial"cadherin，E-cadherin）。

1.3""统计学方法

采用SPSS"20.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（"）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way"ANOAY单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""各组LASP1、miR-625-5p"mRNA表达情况

与空白对照组比较，miR-625-5p"类似物组LOVO细胞中LASP1"mRNA表达水平降低，miR-625-5p"mRNA表达升高（Plt;0.01）。miR-625-5p"抑制剂组LOVO细胞中LASP1"mRNA表达水平升高，miR-625-5p"mRNA表达降低（Plt;0.01）。与miR-625-5p"类似物组比较，miR-625-5p"类似物+LASP1组LOVO细胞中LASP1"mRNA表达水平升高，miR-625-5p"mRNA表达降低（Plt;0.01），见表2。

2.2""LASP1与miR-625-5p的相关关系

miR-625-5p类似物与LASP1基因3’-UTR结合后的荧光素酶检测比值（0.53±0.05）相较于NC类似物组（1.01±0.11）明显降低，miR-625-5p类似物组可降低LASP1的相对荧光素酶活性（Plt;0.01），但对LASP1-Mut，差异无统计学意义（Pgt;0.05）。

2.3""各组LOVO细胞活性变化情况

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组的LOVO细胞活性降低（Plt;0.01），miR-625-5p抑制剂组的LOVO细胞活性升高（Plt;0.01）。与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组的LOVO细胞活性升高（Plt;0.01），见表3。

2.4""各组LOVO细胞的克隆能力变化情况

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组的LOVO细胞克隆数量减少（Plt;0.01），miR-625-5p抑制剂组的LOVO细胞克隆数量增加（Plt;0.01）。与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组的LOVO细胞克隆数量增加（Plt;0.01）。见表4、图1。

2.5""各组LOVO细胞的凋亡影响

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组的LOVO细胞凋亡率升高（Plt;0.01），miR-625-5p抑制剂组的LOVO细胞凋亡率降低（Plt;0.01）；与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组的LOVO细胞凋亡率降低（Plt;0.01）。见表5。

2.6""各组的LOVO细胞迁移、侵袭能力变化情况

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组的LOVO细胞迁移数量、侵袭数量减少（Plt;0.01），miR-625-5p抑制剂组的LOVO细胞迁移数量、侵袭数量增加（Plt;0.01）；与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组的LOVO细胞迁移数量、侵袭数量增加（Plt;0.05）。见表6和图2。

2.7""各组的LOVO细胞增殖影响

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组合并通道橘红色荧光细胞数减少，细胞增殖率降低（Plt;0.01），miR-625-5p抑制剂组合并通道橘红色荧光细胞数增加，细胞增殖率升高（Plt;0.01）；与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组merge通道橘红色荧光细胞数量增加，细胞增殖率升高（Plt;0.01）。见表7。

2.8""各组的LOVO细胞中LASP1、N-cadherin和E-cadherin表达水平

与阴性对照组比较，miR-625-5p类似物组LOVO细胞中LASP1、N-cadherin表达水平降低（Plt;0.05），E-cadherin表达水平升高（Plt;0.05），而miR-625-5p抑制剂组LOVO细胞中上述蛋白表达则完全相反（Plt;0.05）。与miR-625-5p类似物组比较，miR-625-5p类似物+LASP1组LOVO细胞中LASP1表达水平升高（Plt;0.05）。见表8、图3。

3""讨论

CRC是临床病理诊断中常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率常年位于肿瘤疾病前列[8]。但与其相关的靶向治疗等研究还不够深入，使得疾病治疗及患者预后还存在较大问题，因此研究其作用靶点将为患者提供更好的指导。

本研究表明miR-625-5p有抑制LOVO肿瘤细胞活力、同时降低其克隆能力、增殖能力及迁移、侵袭能力的作用，还可促进LOVO细胞发生凋亡。加入LASP1后，细胞的各项进程实验结果与miR-625-5p类似物组所得的实验结论相反，提示miR-625-5p靶向结合LASP1后，LASP1部分逆转miR-625-5p对这些结果的影响。朱海龙等[9]的研究表明，LASP1积聚在黏着斑及片状脂膜的前端和丝状伪足的尖端，这是实现细胞黏附、迁移及细胞通讯的关键结构，进一步为miR-625-5p可靶向结合LASP1进而影响CRC细胞进程提供理论依据。

miRNA在消化系统肿瘤的发生、发展中起到关键作用。miRNA可与靶基因mRNA以不完全互补的方式配对结合，形成沉默复合体，诱导mRNA的降解或影响其翻译进程，使得靶基因的表达被沉默或降低[10]。既往研究表明miR-625-5p可影响多种类型的癌症细胞的增殖和侵袭，与癌症的发生、发展密切相关[11-12]。本研究首先通过细胞转染miR-625-5p类似物及抑制剂构建CRC实验细胞株，用于CRC靶点及其作用机制的探究。qPCR实验各mRNA的表达情况可证明细胞转染成功，为后续实验奠定良好基础。双荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-625-5p类似物与LASP1基因3’-UTR结合后，相较于空载类似物"NC组，荧光素酶检测比值明显降低，说明miR-625-5p类似物可结合LASP1，对LASP1表达水平进行调控，提示LASP1是miR-625-5p靶向结合的关键基因。LASP1是一种肌动蛋白结合蛋白，研究表明LASP1可促进细胞的增殖、迁移及黏附能力，且能在胰腺癌、食管癌等恶性肿瘤中过度表达，与肿瘤的发生发展密切相关[13]。LASP1表达上调与结直肠癌的发生、发展密切相关，敲除LASP1将抑制结直肠癌的增殖和转移[9]。

E-cadherin及N-cadherin均为癌组织上皮细胞的常见表达蛋白，其表达异常与CRC病情进展及肿瘤侵袭程度密切相关[14-15]。E-cadherin是一种Ca2+依赖性跨膜糖蛋白分子，在肿瘤细胞内表达可致细胞黏性下降，对肿瘤细胞转移产生影响[16]。E-cadherin表达缺失是上皮细胞-间充质转化发生的重要标志，与多种肿瘤的不良预后密切相关[17]。与E-cadherin相似，N-cadherin也是一种钙依赖性蛋白，其与细胞的迁移能力呈正相关[18-19]。Western"blot法检测表明，miR-625-5p可降低LASP1、N-cadherin表达水平，升高E-cadherin表达水平，起到降低细胞的黏附及迁移能力，阻碍肿瘤细胞的生长及增殖。而miR-625-5p类似物+LASP1组中由于miR-625-5p与LASP1的靶向结合作用，各蛋白的表达与上述miR-625-5p类似物组结果完全相反。进一步验证miR-625-5p可靶向结合LASP1影响CRC细胞进程。综上，miR-625-5p可靶向结合LASP1抑制结直肠癌细胞的生长、增殖、迁移，并促进凋亡。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–08–22）

（修回日期：2024–11–07）