辅酶Q0增强氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素杀灭大肠杆菌的效果分析

摘要：寻找新型的抗生素佐剂以提高现有抗生素的杀菌效率，实现快速高效杀灭病原菌是降低细菌耐药风险的重要手段。通过外源添加辅酶Q0（CoQ0）联合氨基糖苷类或喹诺酮类抗生素对大肠杆菌进行杀灭效果测试。结果表明：辅酶Q0能够显著增强氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素对大肠杆菌BW25113及8株临床耐药大肠杆菌的杀灭效果。浓度梯度测试和时间依赖性试验结果显示辅酶Q0增强氨基糖苷、喹诺酮类抗生素杀菌具有浓度依赖性和时间依赖性。辅酶Q0最适浓度为30μg mL-¹，其中辅酶Q0辅助庆大霉素的最佳作用时间为5h、辅助氧氟沙星的最佳作用时间为8h。研究结果为开发辅酶Q0作为新型氨基糖苷类或喹诺酮类抗生素佐剂提供了数据支撑。关键词：辅酶Q0;氨基糖苷类；喹诺酮类；抗生素；细菌耐药；大肠杆菌

中图分类号：S859.796文献标志码：A文章编号：0253-2301（2024）09-0030-06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.006

Analysis on the Enhancement of Aminoglycoside and Quinolone Antibiotics’Effect on KillingEscherichia Coli by Coenzyme Q0

LI Ying-hong，LI Jia-chen-chen，WANGZi-han，ZHAO Hang-yu，CHEN Ya-juan*

（Fujian University KeyLaboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation，College of Life Science，Fujian Normal university，Fuzhou，Fujian 350108，China）

Abstract：Finding the new-type antibiotic adjuvant to improve the bactericidal efficiency of the existing antibiotics and achieve the rapid and efficient killing of pathogens is an important means to reduce the risk of bacterial resistance.The bactericidal effect of coenzyme Q0（CoQ0）combined with aminoglycosides or quinolones antibiotics against Escherichia coli was tested by adding the exogenous coenzyme Q0.The results showed that the coenzyme Q0 could significantly enhance the bactericidal effect of aminoglycosides and quinolones antibiotics against Escherichia coli BW25113 and 8 strains of clinical drug-resistant Escherichia coli.The results of concentration gradient test and time-dependent test showed that the coenzyme Q0 enhanced the bactericidal activity of aminoglycosides and quinolones antibiotics in a concentration-dependent and time-dependent manner.The optimal concentration of coenzyme Q0 was 30μgmL¹.The optimal action time of coenzyme Q0 assisted gentamicin was 5 h，and the optimal action time of coenzyme Q0 assisted ofloxacin was 8 h.The results provided data support for the development of coenzyme Q0 as a new-type adjuvant for aminoglycoside or quinolones antibiotics

Keywords：Coenzyme Q0;Aminoglycosides;Quinolones;Antibiotic;Bacterial resistance;Escherichia coli

抗生素用于农业畜牧养殖业上治疗细菌感染无疑是一项重大突破，然而，自抗生素被大量发现并广泛应用的热潮过后，发现或者开发新抗生素的难度越来越大¹-3]。虽然美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的抗生素药物在过去几年呈上升趋势4，然而大部分抗生素在投入使用后不久便发现有对应的耐药菌株产生，耐药菌的进化速度已经显著超越了新抗生素的发现与人工合成步伐，导致泛耐药甚至全耐药的细菌不断涌现5-6。面对抗生素耐药性问题，全世界科学家都在积极致力于耐药机制的研究以寻找新的治疗细菌感染的方法。

抗生素佐剂又被称为“耐药性爆破者”或“抗生素增效剂”。抗生素佐剂与抗生素联合用药时能降低现有抗生素的使用浓度，并且能够降低抗生素带来的副作用。化合物本身几乎没有抗生素活性，但可以阻断耐药性或以其他方式增强抗生素作用7。理想情况下，抗生素佐剂可以通过干扰抗生素灭活酶、膜稳定性或外排泵从而增强抗生素的作用来辅助杀菌。随着研究的不断深入，已有报道表明葡萄糖和丙酮酸与抗生素联合使用能有效增强现有抗生素对耐药菌的抗菌活性，提高杀菌效果[8。此外，新抗生素研发周期长且长期单独用药易产生耐药，由于抗生素与佐剂双重靶点的存在，联合使用的治疗策略在减少用药量和减缓耐药性发展方面具有很大的潜力9，延长了现有抗生素的使用寿命，为临床用药提供了新的治疗选择。

辅酶Q0（CoQ0）是辅酶Q（CoQ）系列化合物，其也称泛醌。辅酶Q（CoQ）在呼吸链中是一种和蛋白质结合不紧密的辅酶，CoQ在电子传递链中处于中心地位。脂溶性的异戊二烯侧链使CoQ在线粒体内膜脂双层中局部扩散，作为一种流动着的电子载体在复合体I（复合体Ⅱ）和复合体Ⅲ之间起传递电子的作用。有报道证实，泛醌氧化还原酶作为Na泵来干扰细菌的质子动力势（PMF）可以作为新的抗生素潜在靶标10;辅酶Q0（CoQ0）已被证明具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性，其对大肠杆菌具有显著的抑菌活性[1]，并且通过破坏金黄色葡萄球菌细胞膜而对金黄色葡萄球菌表现出抗菌作用¹2。CoQ0破坏鼠伤寒沙门氏菌细胞膜完整性并诱导细胞形态变化，导致超极化、细胞内ATP浓度降低和细胞成分泄漏1³]。已有文章报道，CoQ0对食源性病原体阪崎肠杆菌同样具有很强的灭活作用¹4]。基于以上CoQ0对多种细菌的抗菌活性，本研究提出将抗生素与CoQ0联用，尝试杀灭模式生物大肠杆菌-BW25213，将CoQ0开发为新型的抗生素佐剂，以期找到新的抗菌作用靶点，能够降低细菌耐药带来农业畜牧业养殖业上的危机。

1材料与方法

1.1试验材料

大肠杆菌E.coli K-12 BW25113，8株临床耐药大肠杆菌由福建医科大学第一附属医院馈赠。

1.1.1试验药品与仪器试剂药品：辅酶Q0（CoQ0）、无菌磷酸盐缓冲液（pH7.4）。以上药品配制成溶液后均经过0.22μm微孔滤膜过滤确保无菌后备用。（1）试剂药品及使用浓度：CoQ0（30μg mL-¹）。（2）氨基糖苷类抗生素：妥布霉素（Tob 100μgmL-¹）、庆大霉素（Genta 100μgmL-¹）、链霉素（Strep 400μg·mL¹）、卡那霉素（Kana 200μg·mL¹）。（3）β-内酰胺类抗生素：美罗培南（Mer 100μg mL-¹）、羧苄青霉素（Car 200μg·mL¹）。（4）喹诺酮类抗生素：氧氟沙星（Of15μg mL¹）、环丙沙星（Cip5μg·mL¹）。

试验仪器：-80℃冰箱、37℃培养箱、振荡器、超净工作台、离心机、高压灭菌锅。

1.2试验方法

1.2.1菌种培养及稀释点板方法

（1）菌种培养

大肠杆菌活化（BW25113）：取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20%甘油菌液1μL，加至1 mL LB液体培养基中，于37℃摇床（220r·min-¹）培养过夜至平台期，将得到的菌液稀释500倍后接种于20 mL的MHB液体培养基中，37℃摇床（220 r·min-¹）培养过夜20h，得到大肠杆菌培养液。

（2）细菌存活

将处理后的菌液按照每次10倍的梯度用10 mmol-L¹无菌磷酸盐缓冲液（pH为7.4）稀释，稀释梯度为10、10²、10³、10⁴、10⁵，每个稀释度取4μL菌液点滴在LB固体培养基平板上，置于37℃温箱培养12 h后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。

1.2.2 CoQ0辅助氧氟沙星杀灭平台期大肠杆菌的浓度梯度测试取18 mL的大肠杆菌培养液，分装于无菌摇菌管中，分为空白组（control）、单处理组（编号为1～8单加CoQ0，设置浓度梯度1、2、5、10、15、20、25、30μgmL¹）、双处理组（编号为9～16，CoQ0单处理组的浓度下加入氧氟沙星，氧氟沙星最终工作浓度5μg mL¹），将摇菌管置于37℃摇床（220 r·min¹）培养处理5 h。得到的处理后菌液进行无菌磷酸盐缓冲液洗涤2遍，10倍稀释点板，计算细菌存活数。

1.2.3 CoQ0辅助三类杀菌型抗生素杀灭平台期大肠杆菌效果测试取18 mL的大肠杆菌培养液，分装于无菌摇菌管中，随机分为空白组、Tob组、Genta组、Kana组、Strep组、Car组、Ofl组、Cip组、Mer组。每组分为未加CoQ0组（标记为-CoQ0）、加CoQ0组（标记为+CoQ0），加入相应浓度的抗生素与CoQ0后，将摇菌管置于37℃摇床（220 r·min-）培养处理5h。得到的处理后菌液进行无菌磷酸盐缓冲液洗涤2遍，10倍稀释点板，计算细菌存活数。

1.2.4 CoQ0辅助抗生素杀灭大肠杆菌的最佳作用时间测试取8mL大肠杆菌培养液，分装于无菌摇菌管中，随机分为4组，即空白组、Cip组、Ofl组和Genta组。每组分为未加CoQ0组（标记为-CoQ0）、加CoQ0组（标记为+CoQ0），加入相应浓度的抗生素与CoQ0后，将摇菌管置于37℃摇床（220 rpm）培养处理。分别在0、1、3、5、8h后，取出50μL菌液，得到的处理后菌液进行无菌磷酸盐缓冲液洗涤2遍，10倍稀释点板，计算细菌存活数。

1.2.5 CoQ0辅助氧氟沙星、庆大霉素杀灭临床耐药大肠杆菌的效果测试为了验证CoQ0在临床耐药方面的应用价值，本研究从福建医科大学第一附属医院获得8株临床上分离的大肠杆菌耐药菌株，其耐药特性见表1。对8株临床分离出来的大肠杆菌进行杀菌测试，选取测试有效的喹诺酮类抗生素氧氟沙星、氨基糖苷类抗生素庆大霉素作为试验。将临床大肠以1.2.1同样的方式培养，得到大肠杆菌培养液。

每株临床大肠取6 mL大肠杆菌培养液，分装于无菌摇菌管中，随机分为空白组、Ofl组、Genta组。每组分为未加CoQ0组（标记为-CoQ0）、加CoQ0组（标记为+CoQ0），加入相应抗生素以及CoQ0后，将摇菌管置于37℃摇床（220 r·min-¹）培养处理5 h。得到的处理后菌液进行无菌磷酸盐缓冲液洗涤2遍，10倍稀释点板，计算细菌存活数。总共有8株临床大肠杆菌均重复以上步骤。

1.3数据处理与分析

试验数据统计通过ANOVA方差分析，数据来源于3次独立试验。

2结果与分析

2.1 CoQ0辅助氧氟沙星杀灭平台期大肠杆菌的浓度梯度测定

由图1可知，在均不杀菌的反应体系下，双处理组显示出优越的辅助杀菌效果，并且CoQ0浓度越高辅助杀菌效果最好，这表明CoQ0辅助氧氟沙星杀灭平台期大肠杆菌具有浓度依赖效应。选取杀菌效果最好的浓度30μgmL¹开展后续研究。

2.2 CoQ0辅助三大类杀菌型抗生素杀灭平台期大肠杆菌的效果分析

由图2可知，CoQ0能显著增强氨基糖苷类抗生素（Tob、Genta、Kana、Strep）杀灭平台期大肠杆菌，与单处理相比增强了3个数量级以上的杀伤效果。同样CoQ0能增强喹诺酮类抗生素（Ofl、Cip）杀灭大肠杆菌，与单处理组相比能够增强2个数量级及以上的杀伤。而CoQ0没有增强β-内酰胺类抗生素（Car、Mer）的杀菌效果。

2.3 CoQ0辅助氧氟沙星、庆大霉素杀灭平台期大肠杆菌的时间梯度效果分析

为了测试CoQ0联合抗生素处理的最佳作用时间，本研究选取了氨基糖苷类抗生素庆大霉素以及喹诺酮类抗生素作为代表，进行时间杀伤曲线测定。由图3可知，在1 h时CoQ0联合抗生素双处理组辅助杀菌效果已初步显现，随着时间的增加辅助杀伤的效果也随之增加，CoQ0联合Genta组在5h效果达到最佳，CoQ0联合Ofl组的辅助杀伤效果在8h后达到最佳状态。由此可知CoQ0辅助Of1以及Genta杀菌具有时间依赖效应。

2.4 CoQ0辅助氧氟沙星、庆大霉素杀灭平台期临床耐药大肠杆菌的效果分析

由图4可知，在这8株临床分离的耐药大肠杆菌中，与庆大霉素单处理组相比，CoQ0联合庆大霉素双处理对这8株的杀灭效果均有极显著增强；而与氧氟沙星单处理相比，CoQ0联合氧氟沙星双处理对其中6株大肠杆菌无辅助杀菌效果，而对其中215749、305622这两株临床大肠具有2～3个数量级的辅助杀灭效果。

3结论与讨论

目前，畜禽类细菌耐药研究已受到国内外研究人员的广泛关注，已有大量关于畜群细菌耐药的研究报道[15-16]。我国又是世界上最大的抗生素生产和使用国家。抗生素在医疗保健、畜牧养殖等方面有着广泛的用途，对人类传染病的治疗、动物疫病的防治和公众健康的保护具有十分重要的意义。然而，抗生素的大量滥用导致其对人、畜的危害越来越大，有时还会导致敏感菌演变为耐药菌7。特别是某些多药耐药菌的产生，极大地降低了抗菌药物的疗效18]。抗菌药物的开发速度远远跟不上临床的需求，因此，迫切需要找到其他有效的药物来对抗耐药菌。

本研究发现CoQ0能够增效氨基糖苷、喹诺酮类抗生素杀灭大肠杆菌以及临床大肠，并且初步研究其增效抗生素杀菌的效果，而具体其增效杀菌的机制是怎样的？研究人员还需进一步探究。未来还需要对其他多种病原菌进行杀菌验证，以扩展辅酶Q0在多种耐药细菌中的增效杀菌应用。本研究为寻找新型有效地增强抗生素杀菌效果的方法提供新的思路，并为有效降低病原菌产生耐药风险提供新的策略。

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（责任编辑：陈文静）