DFRKN 1碱性磷酸酶功能团的定量分析

摘要：本文研究以根结线虫天敌真菌1分离物为材料，提取纯化得到DFRKN1碱性磷酸酶，并采用化学修饰的方法对酶的必需功能团进行定性分析，确定色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基为酶的活性中心的必需功能团，在此基础上，对DFRKN1碱性磷酸酶的必需功能团进行定量研究。分别用不同浓度N溴代琥珀酰亚胺修饰酶蛋白的色氨酸残基，溴乙酸修饰酶蛋白的组氨酸残基的咪唑基，甲醛修饰酶蛋白的赖氨酸残基，测定酶活性计算反应速度常数，以反应速度常数的变动来确定必需基团的数目，实验结果表明：酶活性中心必需功能团色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基的数目均为一个。

关键词：根结线虫天敌真菌1；碱性磷酸酶；功能团；定量分析

根结线虫是植物根系内定居性寄生物，植物根结线虫病每年可以造成农作物经济损失超过700亿美元。根结线虫的寄主广泛，可以侵染的植物种类超过3000种，其中包括大部分的农作物，可造成农作物10%～20%的减产，严重的可以减产75%，甚至绝产。目前有报道的根结线虫种类可达90种以上，其中南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫是四种常见的根结线虫，造成的经济损失占整个根结线虫引起的作物损失的90%以上。随着城市周边大规模温棚蔬菜生产基地的不断扩大，连作的耕种方式、缺乏新品种引进检疫、防病措施不到位等造成根结线虫发生逐年增加。目前国内根结线虫的防控主要以化学防治为主，化学杀虫剂的使用可以使根结线虫产生抗药性，并且造成环境污染。因此，生物防治根结线虫是一种可持续发展、不污染环境的有效措施。而开发高效稳定的防生菌成为根结线虫防治的关键所在。张靠稳等［1］、马爱瑛等［2］从宁夏温室黄瓜根结线虫上分离得到一株天敌真菌，此分离物对根结线虫有较强的拮抗作用，该分离物能够从根结线虫的卵、二龄幼虫和成虫体表直接侵入，命名为根结线虫天敌真菌1号分离物（DFRKN1）。

碱性磷酸酶（E.C.3.1.3.1）是一类在碱性条件下具有较高催化活性，能催化几乎所有磷酸单酯水解生成正磷酸和对应酯、酚、糖等物质的一组特异性水解酶类，广泛存在于动物、植物及微生物体内，在生物体内有重要作用，直接参与生物体内磷代谢过程，维持体内合适的钙磷比例，是生物代谢过程中重要的调节酶。DFRKN1的碱性磷酸酶稳定性可以反映其代谢稳定性。本文在前期研究的基础上，通过对DFRKN1碱性磷酸酶的功能团的定量分析，以期进一步了解碱性磷酸酶的特性，为深入研究DFRKN1侵入线虫的机理及开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

根结线虫天敌真菌1号分离菌（DFRKN1）由北方民族大学张靠稳教授提供。

1.2主要试剂

2硫代2硝基苯甲酸（DTNB）、溴代乙酸（BrAc）、N溴代琥珀酰亚胺（NBS）、乙酰丙酮、苯甲基磺酰氟（PMSF）为Sigma公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1菌种的培养

将DFRKN1按2%接种到150mL的玉米粉液体培养基中，27℃摇床培养，100r/min，培养3～5天。

1.3.2碱性磷酸酶的分离与纯化

碱性磷酸酶的分离纯化参考文献进行［3］。

1.3.3酶活力的测定

碱性磷酸酶水解底物pNPP产生硝基苯酚（pNP）和无机磷酸（HPO42），硝基苯酚在405nm处有最大的吸收峰［4］。

酶活力（单位）=△A405×1000

1.3.4酶的必需基团的定性分析

采用DTNB（2硫代2硝基甲酸）、NBS（N溴代琥珀酰亚胺）、乙酰丙酮、PMSF（苯甲基磺酰氯）、BrAc（溴乙酸）、甲醛等化学修饰剂处理酶液。修饰后测定碱性磷酸酶的酶活。

1.3.5酶活性中心必需基团的定量分析

按夏初临等［5］采用的方法，对酶活性中心的必需基团进行定量分析。首先判断酶的修饰反应属于一级反应，以剩余酶活力的对数对修饰时间作图。然后测定修饰反应的一级速度常数，以反应速度常数的变动来推断必需基团的数目。在不同浓度的化学修饰剂下，测定酶失活的一级速度常数（k1），以对数作图法作lgk1与lg［I］的关系，从直线的斜率求必需基团的数目。

2结果与分析

2.1必需功能团的定性分析

DTNB在一定条件下能专一地修饰巯基，实验中当DTNB的浓度达到4mmol/L时，对酶活力基本没有影响，说明巯基不是酶活性中心必需的官能团。

用NBS修饰碱性磷酸酶时，酶剩余活力随NBS浓度增加而急剧下降，当NBS浓度达到0.4mmol/L时，酶活力仅剩11.40%（如图1所示），NBS在适宜条件下，能作用于巯基和色氨酸的吲哚基，从DTNB对酶的修饰结果可以得出巯基不是必需基团之一，所以NBS对酶的修饰作用说明了色氨酸是酶的活性中心的必需基团之一。

乙酰丙酮在碱性条件下能修饰精氨酸，从实验结果可以看出，乙酰丙酮的浓度在10～20mmol/L范围内时酶活力随浓度增大而降低；但当浓度达到40mmol/L以上时，酶活力基本不再变化；当浓度达到100mmol/L时，酶活力尚剩余62.30%，说明精氨酸可能与维系酶活性中心的构象有关，但并非必需功能团。

苯甲基磺酰氯（PMSF）在碱性条件下能专一性地修饰丝氨酸残基，实验结果表明，当PMSF浓度达到0.4mmol/L时，酶活剩余32.40%，且酶活力基本不再变化，说明丝氨酸与酶活力有关，但也并非必需功能团。

溴乙酸（BrAc）在偏酸性的条件能专一性地修饰组氨酸的咪唑基，从实验结果（如图2所示）可以看出，随着BrAc浓度的增加，酶活力急剧下降，当BrAc的浓度达到80mmol/L时，酶活力仅剩3.64%，由此说明组氨酸残基是酶活力中心的必需功能团。

甲醛在偏酸性的条件下能修饰氨基，从实验结果（如图3所示）可以看出，酶活力随着甲醛浓度的增大而急剧下降，当甲醛浓度达到4%时，酶活力仅剩6.37%，说明赖氨酸侧链的氨基也是酶活性中心的必需功能团之一。

2.2酶活性中心色氨酸残基数的测定

采用不同浓度（0.1～0.4mmol/L）的NBS修饰酶蛋白，反应10min即可修饰完全。每隔2min取出酶液测定的酶活力，以相对酶活力的对数lg（Ag）对修饰时间作图为直线，说明NBS对酶的修饰作用使酶失活是按一级反应进行的。根据一级反应速度常数k1与酶活力失活一半的时间T1/2的关系为：k1=0.693/T1/2，求出不同NBS浓度下的k1值，再根据公式：k1=k2［I］n，即lgk1=lgk2+nlg［I］。以lgk1对lg［NBS］作图（见图4），得斜率n=0.813，近似n=1，即酶活性中心必需的色氨酸残基为一个。

2.3酶活性中心组氨酸残基数的测定

在不同浓度（20～80mmol/L）的BrAc下，测定其对酶的失活过程，每隔5min测定一次酶活力，以剩余相对酶活力的对数lg（Ag）对修饰时间作图为直线，说明BrAc对酶的修饰使其失活是按一级反应进行的。一级反应速度常数k1对lg［BrAc］作图（见图5），斜率即为n=0.837，近似n=1，则酶活性中心必需的组氨酸残基数为1。

2.4酶活性中心赖氨酸残基数的测定

研究不同浓度的甲醛（1%、2%、3%、4%、5%）作用下酶活力的变化，测定其对酶的修饰失活过程的酶活力，计算出相对酶活力，以剩余相对酶活力的对数lg（Ag）对修饰时间作图为直线，说明甲醛作用于酶使其失活是按一级反应进行的。以一级反应速度常数k1对lg（甲醛浓度）作图（见图6），斜率即为n=0.863，近似n=1，则酶活性中心必需的赖氨酸残基数为1。

3结论与讨论

实验主要是对来自根结线虫天敌真菌中的碱性磷酸酶的功能团进行定量研究，首先对酶进行纯化处理，得到酶纯化倍数达27.17，比活力达10514，达到电泳纯。再对酶的必需功能团进行定性研究，定性研究是定量研究的前提。

DFRKN1碱性磷酸酶活性中心的必需功能团有色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基，这与多数研究中的碱性磷酸酶必需功能团的研究结果相同，说明碱性磷酸酶的必需功能团有着一定的相似性，但不同来源地碱性磷酸酶的必需官能团也存在差异。

本实验结果表明，测定色氨酸的数目时，得到的直线斜率n=0.813，近似整数为n=1，表明每个酶分子仅结合一个NBS分子活力就会几乎完全丧失，说明每个酶分子的活性中心中仅有一个色氨酸残基是酶活性所必需的。同样的由实验结果也可以得出组氨酸残基、赖氨酸残基的数目也都是一个。

参考文献：

［1］张靠稳，金赛.宁夏贺兰山农牧场日光温室根结线虫天敌真菌的分离和初步鉴定［J］.北方园艺，2009（7）：157159.

［2］马爱瑛，张靠稳，杨晓燕.根结线虫天敌真菌1（DFRKN1）菌株的鉴定［J］.贵州农业科学，2010，38（1）：6869.

［3］张靠稳，马爱瑛，叶东平，等.DFRKN1碱性磷酸酶的提取纯化和主要理化性质研究［J］，安徽农业科学，2008（26）：1118111183.

［4］陈清西，颜思旭.文昌鱼ALPase底物特异性及其效应物对酶活力的影响［J］.厦门大学学报（自然科学版），1989（1）：9296.

［5］夏初临，陈惠黎.谷胱甘肽S转移酶活性中心的研究：羧基、氨基和胍基的化学修饰［J］.中国生物化学与分子生物学报，1991，7（3）：327332.

基金项目：北方民族大学“大学生创新创业训练计划”项目（S202311407005）

作者简介：蒋华珍（2003—），女，汉族，四川广安人，本科在读，研究方向：生物技术。

*通讯作者：马爱瑛（1978—），女，回族，内蒙古赤峰人，副教授，研究方向：生物化学与分子生物学。