模拟胃液环境下谷维素清除亚硝酸钠及阻断亚硝胺的作用

摘要：为降低人体内亚硝胺类化合物含量，采用模拟胃液结合液质联用的方法研究谷维素清除亚硝酸钠及阻断亚硝胺的作用。结果表明：在模拟胃液条件下，谷维素能有效清除亚硝酸钠，且亚硝酸钠的清除率与谷维素液添加量呈正相关关系；在膳食样品中添加谷维素能有效降低N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基吡咯烷的含量，其阻断率分别为100%、100%和24.4%。谷维素在模拟胃液条件下能通过降低亚硝酸钠含量减少内源性亚硝胺合成的反应底物，从而阻断亚硝胺的合成。

关键词：谷维素；亚硝胺；亚硝酸钠；模拟胃液；液质联用

中图分类号：TS 201.6 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）10-0087-05

Oryzanol Clears Sodium Nitrite and Blocks the Synthesis of Nitrosamine in

Simulated Gastric Fluid

YU Feng-xiang1，CHEN Xu2，CHEN Zu-wu2，ZENG Si-jing3

（1. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic， Changsha 410127， PRC; 2. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 3. Longhui Market Supervision and Management Inspection and Testing Center， Shaoyang 422299， PRC）

Abstract： To reduce the content of nitrosamines in the human body， this study employed liquid chromatography-mass spectrometry to explore the performance of oryzanol in clearing sodium nitrite and blocking the synthesis of nitrosamine in simulated gastric fluid. The results showed that in simulated gastric fluid， oryzanol cleared sodium nitrite， and the removal rate was in a positive correlation with the oryzanol addition amount. Adding oryzanol in the diet reduced the content of N-nitroso-N-ethylaniline， N-nitroso-diethylamine， and N-nitroso-pyrrolidine， with the blocking rates of 100%， 100%， and 24.4%， respectively. In simulated gastric fluid， oryzanol can reduce the substrate of endogenous nitrosamine synthesis by reducing the content of sodium nitrite， thus blocking the synthesis of nitrosamine.

Key words： oryzanol; nitrosamine; sodium nitrite; simulated gastric fluid; liquid chromatography-mass spectrometry

亚硝酸盐和胺类物质广泛存在于食物中，这些物质摄入人体后，在胃液的作用下容易产生致癌的亚硝基化合物——亚硝胺[1-2]。亚硝胺是一种强烈的化学致癌物质，长期摄入含有高浓度亚硝胺的食品可能会增加胃癌、食道癌等的患病风险。因此，大部分国家和地区除了对亚硝胺类化合物本身进行管控外，还对亚硝胺可生成物有限量要求。世界卫生组织国际癌症研究机构已将N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、“在导致内源性亚硝化条件下摄入的硝酸盐或亚硝酸盐”等列为2A类致癌物；我国GB2762—2022标准规定肉及肉制品、水产动物及其制品中N-二甲基亚硝胺（NDMA）限量分别为不超过3、4 μg/kg；美国农业部规定肉制品中总挥发性亚硝胺限量为10 μg/kg[3]；俄罗斯国家规定生食品和烟熏食品中N-亚硝胺含量不得超过2、4 μg/kg[4]。

减少NO2-及NO3-的摄入是减少内源性亚硝胺形成的关键一步。

目前，主要通过控制食品加工条件、加入抗氧化物质（维生素C[5]、维生素E[6]、花色苷[7]、生姜抗氧化物[8]、大黄[9]等）等方法阻断亚硝胺的合成。为简化样品处理流程，解决亚硝胺类物质因热稳定性差而不易检测的难题，学术界普遍采用液相色谱、气质联用改良法、液质联用等方法对其进行分析检测，但都存在检测时间长、过程繁琐等问题，具有较大的优化空间[10-11]。

γ-谷维素具有清除自由基、抗氧化、降血脂、降血糖、抑制癌细胞生长、调节中枢及心脏自主神经等功能，但其对亚硝胺的阻断效果及机理研究尚未见报道。前期试验发现在蔬菜腌制时加入谷维素，会降低产品亚硝酸钠含量[12]。笔者通过模拟胃液环境结合液相色谱-质谱联用法，研究谷维素清除亚硝酸钠及阻断亚硝胺的效果，为人体内源性亚硝胺合成的阻断技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

主要试剂材料有亚铁氰化钾溶液（106 g/L）、乙酸锌溶液（220 g/L）、饱和硼砂溶液（50 g/L）、氨缓冲溶液（pH值9.6～9.7）、20%盐酸、对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）、95%食用酒精、醋酸、甲醇（色谱纯）、亚硝酸钠标准使用液（5 μg/mL）、粉状活性炭。亚硝酸纳标准溶液（200 μg/mL，优级纯，坛墨质检科技股份有限公司）；谷维素（≥99.9%，瑞威尔生物科技有限公司）；模拟胃液（pH值1.5±0.1，广州臻萃质检技术服务有限公司）；亚硝胺标准品包括N-亚硝基二甲基胺（NDMA）、N-亚硝基二乙基胺（NDEA）、N-亚硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）、N-亚硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亚硝基二苯基胺（NDPhA）、N-亚硝基二丙基胺（NDPA）、N-亚硝基二丁基胺（NDBA）、N-亚硝基吡咯烷（NPYR）、N-亚硝基吗啉（NMOR）和N-亚硝基二苄胺（NDBzA），均购自美国O2si公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290 Infinity II-6470液相色谱质谱联用仪（LC-MSMS，安捷伦科技有限公司），ZORBAX SB-CN液相色谱柱（21 mm×100 mm，1.8 μm；安捷伦科技有限公司），UV-1800PC紫外可见分光光度计[翱艺仪器（上海）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 谷维素液的制备 为使谷维素更好地溶解于胃液体系，后续应用于食品加工，需将其配制成稳定的溶液。谷维素不溶于水，以52%普通食用白酒、75%乙醇、无水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）进行试验，研究制备谷维素液的最适配方。

1.3.2 亚硝胺的液质联用检测 （1）对照品溶液配制：精密量取12种亚硝胺混标（均为100 mg/mL）0.25 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀释，并定容至25mL，摇匀即配得浓度均为1 mg/mL的溶液。（2）加标供试品溶液配制：称取样品1.00±0.05 g于玻璃比色管中，加入12种亚硝胺0.2 mL，加入2 mL甲醇，涡旋30 s，静置2 min，取上层溶液，过滤膜上机测试。（3）上机条件：柱温40℃，进样量5 μL，流速0.4 mL/min，流动相A为含0.1%甲醇和5 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件如表1所示。

1.3.3 谷维素对亚硝酸钠的清除率检测 于25 mL比色管中加入模拟胃液10 mL，分别加入谷维素液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，再加入5

μg/mL亚硝酸钠标液2 mL，37℃水浴120 min取出，

加入0.4%对氨基苯磺酸2 mL，混匀，静置5 min后，各加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL，静置15 min，加水至刻度混匀。用0.45 μm滤膜过滤，在538 nm下测定吸光度Ai。空白调零：以去离子水代替谷维素液和亚硝酸钠标液。不加谷维素液的样品吸光度记为A0；对照为不加亚硝酸标准液的样品，以扣除谷维素自身可能带来的吸光度误差，对照吸光度记为A0i。根据公式（1）计算亚硝酸钠清除率（R）。

（1）

1.3.4 谷维素对膳食亚硝胺的阻断率检测 参考中国居民膳食宝塔及《中国居民膳食指南》，按表2设计食谱。称取200 g经料理机均质后的混合物，添加200 mL模拟胃液，试验组添加0.02%谷维素，混匀。把混合物放在震荡保温箱里，37℃保温2 h；准确称取1.00±0.05 g样品于玻璃比色管中，加入2 mL甲醇，涡旋30 s，静置2 min，上层溶液用滤膜过滤，再用液质联用仪检测亚硝胺物质种类和含量。根据公式（2）计算阻断率（C）。

（2）

式中：ρ0为不加谷维素液的样品中亚硝胺的质量浓度（ng/mL），ρi为加入谷维素的样品中亚硝胺的质量浓度（ng/mL）。

1.4 数据分析

使用Matlab 2014、SPSS 17.0和Excel 2010软件分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 谷维素液的制备结果

常温下，谷维素在52%普通食用白酒、75%乙醇、无水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）中的溶解度极小；加热后，可溶于无水酒精、食用油、醋酸、95%食用酒精。若浓度过高，溶解后加入其他试剂或泡菜液中，会析出白色絮状物质。经反复试验，取0.5 g谷维素，加入95%食用酒精15 mL溶解，加入85 mL沸水继续煮沸，冷却定容至100 mL。该方法制备的谷维素液可形成稳定的米汤状液体，离心不沉淀，存放1个月状态良好，且满足食品加工要求。

2.2 模拟胃液条件下谷维素对亚硝酸钠的清除率

由图1可知，整体而言，亚硝酸钠的清除率随着谷维素液添加量增加而提高，说明谷维素在模拟胃液条件下能有效清除亚硝酸钠，减少内源性亚硝胺合成的底物。

2.3 模拟胃液条件下谷维素对膳食亚硝胺合成的阻断率

2.3.1 膳食中亚硝胺种类 由表3可知，膳食中亚硝胺物质主要有NEPhA、NDMA、NMEA、NDEA、NDBA、NPYR，亚硝胺混合标准样品的色谱图如图2所示，样品离子流如图3所示，MRM定量离子图如图4所示。GB 2762—2022标准中规定N-亚硝基二甲基胺（NDMA）在肉及制品、水产动物及其制品中的限量分别为3.0、4.0 μg/kg，参考这一数值，推测膳食样品N-亚硝基吡咯烷（NPYR）含量存在安全风险。

2.3.2 谷维素对膳食亚硝胺的阻断率 由表4可知，添加谷维素主要影响了膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量。NEPhA、NDEA在空白对照样品中的含量分别为1.6 ng/g和0.2 ng/g，而添加谷维素的样品中未检出该种亚硝胺，阻断率为100%；空白对照样品中的NPYR含量为8.6 ng/g，试验组中NPYR含量为6.5 ng/g，阻断率为24.4%。添加谷维素对NDMA、NMEA、NDBA的阻断效果不明显，其原因有待进一步分析。

3 结论

在模拟胃液条件下，谷维素能有效清除食品中的亚硝酸钠，且亚硝酸钠的清除率与谷维素液添加量呈正相关关系。此外，谷维素在模拟胃液条件下通过降低亚硝酸钠含量减少内源性亚硝胺合成的反应底物，阻断了亚硝胺合成，在膳食中添加谷维素能有效降低膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量，其亚硝胺阻断率分别为100%、100%和24.4%。

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（责任编辑：王婷）