核桃焦叶病诱导的形态响应

关键词：核桃焦叶病；生长；木质部茎比导水率；叶片结构

中图分类号：S664.1；S718.4 文献标志码：A 文章编号：1003—8981（2024）03—0188—09

新疆是我国核桃Juglans regia L. 的重要发源地之一，拥有悠久的栽培历史[1]。得益于新疆塔里木盆地绿洲的充足光照、热量资源和适宜的土壤条件，以及当地科技工作者在核桃栽培和品种选育方面的不懈努力，新疆干旱区的绿洲已经成为中国主要的核桃生产区之一。截至2022 年底，新疆核桃的种植面积达到42 241.53 hm²，位居新疆林果业之首、全国第六，产量达到113.2×10⁴ t，占全国核桃总产量的1/4。核桃种植业已成为新疆南疆盆地核桃主产县（市）农村经济发展和农民可持续增收的关键产业。随着核桃产业的发展，核桃病虫害也随之发生[2]，其中核桃焦叶病于2012 年在新疆和田地区被首次报道[3]。截至目前，核桃焦叶病已在阿克苏、喀什、和田等新疆南疆核桃主产区大面积发生。发病核桃树光合作用受阻[4-5]，商品率仅为健康核桃树的50% ～ 70%[3]。

研究表明，叶部病害会对林木形态造成不利影响。在外部形态结构研究中，紫韧革菌Stereumpurpureum （P.） Fr. 侵染苹果Malus domestica L. 叶片后通过释放毒素影响树体生理代谢活动，导致苹果树生长减缓、叶片缩小、产量降低，严重时导致树木死亡，并在枯死树木的枝干上形成特有的真菌结构[6]。梨Pyrus communis L. 在不同品种、生产园、果实发育时期表现出的黑斑病[7]、褐斑病[8]、斑点病[9] 病害严重程度与早期落叶率呈正相关，对落叶率的影响在不同品种、果园和时间段内普遍存在[10]。乌拉圭的蓝桉Eucalyptus globulus L.种植园受到球腔菌Mycosphaerella 影响时生长减缓、落叶率上升，存活率受到影响[11]。

在内部结构研究中，以桃树Prunus persica （L.） B.缩叶病为例，感病叶片的栅栏组织细胞层数和细胞直径均大于健康叶片；随着症状的发展，感病叶片的栅栏组织逐渐消失，同时叶肉细胞内的叶绿体数量明显减少，甚至在部分细胞中观察不到叶绿体，这种情况显著减弱了树体的活力，直接影响当年的果实产量和次年的花芽发育[12]。此外，葡萄扇叶病毒在寄主细胞内特定排列，对线粒体和叶绿体的结构造成破坏，进而影响细胞功能[13]。脐橙Citrus sinensis （L.） O. 在感染黄龙病后，叶片变薄，气孔受损，栅栏组织细胞形态由长条形变为椭圆形，细胞间隙扩大，细胞排列疏松，果蒂韧皮部的部分维管束发生堵塞[14]。截至目前，关于核桃的生长指标及电镜观察研究尚未涉及核桃焦叶病发病后的具体变化情况。

鉴于此，本研究基于生长参数测量和显微观察技术，定量分析核桃焦叶病发生进程中1 年生结果枝长度、基径生长速率以及木质部茎比导水率变化情况，定性分析核桃焦叶病发生进程中叶片、叶柄、枝条结构的变化特征，明确焦叶病发生进程中核桃形态学变化，为深入了解核桃焦叶病的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本研究田间试验地点位于阿克苏地区阿瓦提县（41°11′06.31′′ ～ 41°12′47.74′′N，79°12′ 12.76′′ ～79°13′57.87′′E）。该地区属暖温带大陆性干旱气候，年平均气温9.4 ℃，平均降水量91.5 mm。主要栽培核桃品种‘温185’、授粉品种‘新新2 号’，树龄为7～11年生，行间距5 m，株间距3 m。

1.2 试验材料

2021年，选取试验园中10年生‘温185’核桃树30 株，于每株样株树冠外围东西南北4 个方向共选取健康（未感染焦叶病）的1 年生结果枝10 个，挂牌标记，依次编号1～300，以便后期测量及采样。其中1～200号1年生结果枝（A 组）用于枝条长度、基径测定；201～300号1年生结果枝（B 组）用于电镜观察。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃1年生结果枝长度、基径测定

分别于2021年、2022年、2023年5月中旬和8 月下旬（100 d）测定‘温185’1年生结果枝健康和感病枝条（感病枝条：带有感病叶片的枝条）的长度、基径（基部1 cm 处测量），精度0.01 mm，计算1 年生结果枝长度增量及基径增量[15]。2021、2022、2023年测量时挂牌标记的枝条剩余数量分别为184 根（健康127 根，感病57根）、179根（健康103根，感病76 根）、181根（健康114根，感病67 根）。

1.3.2 核桃木质部茎比导水率测定

分别于2021年、2022年、2023年8月下旬采集‘温185’0.1 m 长1年生结果枝健康和感病枝条各10根。将采集的枝条完全浸没在水中，防止干燥。然后将枝条放入植物导水率高压测试仪的压力室内，确保密封良好，避免空气泡影响测量。

设定压强为4.9×10^-3 MPa，时间300 s，通过过滤器使用CaCl 溶液测定枝条的初始导水率K0 和样品茎比导水率Ks[16]。X 为通过枝条CaCl 溶液重量（kg），S 为枝条木质部横截面积（m²）。计算公式如下：

K=X÷300÷（4.9×10^-3）。 （1）

K=K×0.1÷S。 （2）

1.3.3 核桃1年生结果枝显微结构观察

2023年8月中旬采集1年生结果枝的枝条、叶柄、叶片（病叶样品按照核桃焦叶病病叶分级标准采集，均取未发病部位叶肉部分），进行解剖结构观察。样品置于FAA 固定液中[17] 初步固定。

1）叶片显微结构观察

所采集样品经过以下步骤处理：首先，依次在30%、50%、70%、80%、95%、100% 乙醇中各脱水2 h；然后，依次在50%、100% 二甲苯溶液中各透明处理3 h；最后，依次在37 ℃的50%和60 ℃的70%、100% 石蜡溶液中浸蜡，每个步骤持续3 d。完成包埋、修块、切片和烤片后，采用番红- 固绿染色法进行染色。染色后的样本经中性胶封片后，在40℃的干燥箱中干燥[18]。使用Leica DM6000B显微镜系统观察并测量叶片的总体厚度、栅栏和海绵组织厚度，以及上表皮的厚度。

2）枝条叶柄显微结构观察

将叶柄纵切、枝条横切后使用冻干机去除样品中的水分。冻干处理后，使用镊子将样品粘至有双面胶的样品台上，转移至日立E-1045 离子溅射仪，对样品表面进行喷金处理[19]，以增强样品的电导性和提高图像质量。将喷金后的样品固定在显微镜的样品台上，使用SUPRA 55VP 扫描显微镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 焦叶病对核桃1年生结果枝长度及基径增量的影响

对2021年、2022年、2023年5月上旬至8月中旬（100d）‘ 温185’1年生结果枝健康枝条及感病枝条长度及基径增量进行多重比较（图3）。结果显示，2021年、2022年、2023年‘温185’1年生结果枝健康枝条长度增量、基径增量均显著高于感病枝条（P＜0.05）。2021年， 与健康枝条（60.54 mm） 相比， 感病枝条（50.46 mm）1 年生结果枝长度增量下降16.65%；2022年，与健康枝条（64.28 mm）相比，感病枝条（43.84 mm）1 年生结果枝长度增量下降31.80%；2023 年，与健康枝条（65.46 mm）相比，感病枝条（51.75 mm）1 年生结果枝长度增量下降20.94%。2021 年，与健康枝条（2.94 mm）相比，感病枝条（2.24 mm）1 年生结果枝基径增量下降23.80%；2022 年，与健康枝条（3.03 mm）相比，感病枝条（2.11 mm）1 年生结果枝基径增量下降30.36%；2023 年，与健康枝条（2.97 mm）相比，感病枝条（2.18 mm）1 年生结果枝基径增量下降26.60%。

2.3 焦叶病对枝条、叶片结构的影响

随着叶片焦叶病病级的升高，叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度逐渐下降。多重比较结果（表2）显示，Ⅰ级叶片厚度最大，为（201.44±9.89）μm，显著大于其他病级（P＜ 0.05）；Ⅱ级叶片厚度为（188.04±4.31）μm，与Ⅰ级叶片相比有所下降，但仍然显著大于Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片（P ＜ 0.05）；Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片的叶片厚度分别为（176.53±6.95）μm 和（162.05±5.88）μm，两者之间存在显著差异（P ＜ 0.05）。随着病级的增加，栅栏组织厚度显著减少（P ＜ 0.05）；Ⅰ级叶片的栅栏组织厚度为（104.42±4.30）μm，显著大于其他病级（P ＜ 0.05）；Ⅱ级叶片的栅栏组织厚度为（95.44±3.10）μm，与Ⅰ级叶片相比有所减少，但仍然显著大于Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片（P ＜0.05）；Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片栅栏组织厚度分别为（82.97±6.64）μm 和（72.20±4.70）μm。随着病级的增加，海绵组织厚度显著减少（P ＜ 0.05）；Ⅰ级叶片的海绵组织厚度为（79.02±4.32）μm，显著大于其他病级叶片（P ＜ 0.05）；Ⅱ级叶片的海绵组织厚度为（70.44±2.51）μm，与Ⅰ级叶片相比有所减少，但仍然显著大于Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片（P ＜ 0.05）；Ⅲ级叶片和Ⅳ级叶片的海绵组织厚度分别为（63.20±5.93）μm 和（58.39±3.52）μm。随着病级的增加，上表皮厚度显著减少（P＜ 0.05）；Ⅰ级叶片上表皮厚度为（19.32±2.05）μm，显著大于其他病级（P ＜ 0.05）；Ⅱ级叶片的上表皮厚度为（18.76±1.66）μm，与Ⅰ级叶片相比略有减少， 无显著差异（P ＞ 0.05）； Ⅲ 级叶片和Ⅳ级叶片的上表皮厚度分别为（16.60±1.78）μm 和（14.63±1.70）μm。

由图3 可知，健康叶片与发病叶片在细胞形态结构上存在显著差异。在Ⅰ级健康叶片中，海绵组织区域没有观察到明显的空洞，表皮细胞也没有明显的突起或断裂。Ⅱ级感病叶片的部分叶肉细胞开始破裂，海绵组织区域出现了少许空洞，叶肉细胞内部有破损的游离细胞。随着病情的恶化，Ⅲ级叶片的上下表皮细胞出现扭曲变形，但未观察到明显的凸起或断裂。在病情极为严重的Ⅳ级叶片中，上表皮细胞进一步扭曲变形，海绵组织区域出现大量空洞，叶肉细胞内部的破损细胞数量增多，下表皮细胞也开始解体，并出现了凸起和断裂的现象。

图4显示，Ⅰ级健康叶片叶柄区域的纹孔膜结构完整，表面光滑无异常。Ⅱ级感病叶片的叶柄纹孔膜表面变得粗糙。随着病情的加剧，Ⅲ级叶片叶柄纹孔膜上开始出现白色颗粒物。在病情极为严重的Ⅳ级叶片中，叶柄纹孔膜部分破裂，形成了网状结构。

图5显示，健康1 年生结果枝木质部的螺纹导管保持畅通，没有发现任何堵塞现象。相比之下，在Ⅱ级感病枝条木质部螺纹导管内观察到了白色颗粒物。随着病害的进一步发展，Ⅲ级感病枝条木质部螺纹导管内出现絮状结构，螺纹导管局部堵塞。在病情极为严重的Ⅳ级枝条螺纹导管中出现块状物，螺纹导管被大面积堵塞。

3 讨论

研究发现，焦叶病抑制‘温185’核桃1 年生结果枝的生长，减少了枝条长度和基径增长量。从观察叶片解剖结构可知，随着焦叶病病级的升高，叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度及上表皮厚度均呈下降趋势，并且海绵组织细胞逐步降解、出现大量空洞，感病枝条叶片功能受损。叶片受损后，光合作用效率降低[4-5]，从而导致能量和碳源供应不足，进而影响了枝条细胞分裂和生长所需的物质基础和能量物质。有研究显示铬胁迫也会导致叶片厚度变薄[20]。

本研究还发现在感病枝条中，木质部螺纹导管内出现的白色颗粒物和絮状结构引起了导管的堵塞。这种堵塞不仅扰乱了植物的水分平衡，还可能加快病害进程，形成负面循环[21]。此外，纹孔膜是细胞间交换水分和养分的关键通道，叶柄处的纹孔膜损伤加剧了水分和养分运输的问题[22]，进一步削弱了植物的生长状况[23]。因此，木质部螺纹导管的堵塞和纹孔膜的破坏是导致核桃植株生长发育受阻的因素。这些病理变化共同作用，导致了枝条生长减弱。这种现象可能与干旱胁迫有关[24]。

尽管多数学者将核桃焦叶病归类为生理性病害，但大量研究指出，木质部导管的堵塞往往与特定病原物的参与密切相关。这些病原物通过不同的机制导致导管堵塞，进而影响植物的正常生长和发育。例如，大丽轮枝菌Verticillium dahliaeK. 能够引起黄栌Cotinus coggygria S. 导管内部产生胶状物和侵填体，这些物质的形成直接导致了导管的堵塞[25]；镰刀菌Fusarium pseudograminearumT. Ito & Kurata 的菌丝和分生孢子可以在导管内繁殖，产生填充物，也是导管堵塞的重要原因[26]。此外，木质部难养菌Xylella fastidiosa 在附着于柑橘Citrus reticulata B. 木质部壁后，其细胞数量增加并产生纤维素物质，形成由无定形物质、纤维和细菌细胞组成的生物膜，这一过程同样导致了导管的阻塞[27]。受感染的植株叶片中出现含胶质物质和酚类物质，并且有过度增生和肥大的症状。扫描电子显微镜图像显示，X. fastidiosa 感染的葡萄茎节横断面与核桃焦叶病中木质部螺纹导管的堵塞情况高度相似[28]。有研究表明，在纹孔膜受损的情况下，细菌和空气能够畅通无阻地通过单个或多个相连的木质部导管[29]，在植株体内移动。这种连通性可能是由于纹孔膜的破损，使得茎的木质部与叶片之间建立了直接的联系。研究人员针对X. fastidiosa 产生的两种酶类进行了测试，并观察到这些细胞壁降解酶[30]（聚半乳糖醛酸酶和β-1，4- 内切葡聚糖酶）能够改变纹孔膜的孔隙度，形成孔洞[31]。

尽管本研究已经揭示了焦叶病对核桃生长及内部结构的影响，但关于病原体的深入研究尚显不足。我们怀疑核桃焦叶病与特定病原物相关。为了深入了解核桃焦叶病的成因，未来的研究应当聚焦于病原菌的生物学特性、致病机理及其与宿主植物的互作关系。特别是，通过分离和纯化病原菌，详细研究其生活周期、传播途径和侵染的临界条件，将有助于揭示焦叶病发生的具体原因。

4 结论

本研究主要对‘温185’1年生结果枝健康枝条与感病枝条的长度增量、基径增量以及木质部茎比导水率进行了差异分析，并对感病枝条与健康枝条及其叶片进行了显微结构观察。主要研究结果如下：

与健康枝条相比，‘温185’1年生结果枝感病枝条的长度增量、基径增量及木质部茎比导水率显著低于健康枝条（P＜0.05）。长度增量：健康枝条63.42 mm，感病枝条48.68 mm；基径增量：健康枝条2.98 mm，感病枝条2.17 mm；木质部茎比导水率：健康枝条9.00 kg·m^-1·s^-1·MPa^-1、感病枝条2.55 kg·m^-1·s^-1·MPa^-1。

叶片解剖结构的多重比较结果显示，随着焦叶病病级的升高，叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度以及上表皮厚度均呈下降趋势。健康叶片细胞结构完好，无空洞和表皮损伤。而感病叶片叶肉细胞破裂、海绵组织出现空洞、游离细胞破损。随病情加剧，表皮细胞扭曲变形，严重时上表皮严重扭曲，海绵组织空洞增多，叶肉细胞破损加剧，下表皮出现断裂。发病叶片的叶柄纹孔膜表面变得粗糙，严重时出现破裂，影响了水分和养分的运输。同时，在感病枝条的木质部螺纹导管内观察到白色颗粒物和絮状结构，螺纹导管堵塞。

综上所述，焦叶病破坏叶片结构，导致木质部导管堵塞，降低木质部茎比导水率，最终抑制了‘温185’核桃1 年生结果枝枝条生长。