基于网络药理学和SPR检测探讨生脉散治疗2型糖尿病合并冠心病的作用机制

摘要：目的 探讨生脉散治疗2型糖尿病（T2DM）合并冠心病（CHD）的作用机制。方法 应用TCMSP、BATMAN-TCM和Uniprot数据库检索生脉散药效成分及对应靶点，应用Genecards、Drugbank和TTD数据库检索T2DM和CHD靶点基因，运用Venny2.1.0工具得到疾病交集靶点，采用Cytoscape3.9.1软件，建立药效物质-成分-靶点的网络图谱，通过STRING构建PPI网络，并获取排名前10的关键靶点基因，通过R语言ClusterProfiler包进行GO功能和KEGG通路分析，使用Discovery Studio软件完成分子对接，最后完成SPR检测实验验证。结果 获得生脉散207个药效成分，对应1643个相关作用靶点;T2DM疾病靶点2663个，CHD疾病靶点1206个，疾病-药物交集靶点337个;最终获得3个关键靶点：AKT1、CTNNB1、ESR1;GO和KEGG分析发现涉及的生物学通路主要有MAPK、AGE-RAGE、TNF等信号通路;将上述得到的结果进行分子对接，并选取AKT1蛋白和相关有效成分完成表面等离子共振SPR结合检测，结果显示均有较好活性。结论 生脉散可能从多成分、多靶点和多途径调控糖脂代谢、改善氧化应激等方面来发挥治疗T2DM合并CHD的作用。

关键词：2型糖尿病;冠心病;生脉散;网络药理学;SPR检测

中图分类号：R259 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.20.001

文章编号：1006-1959（2024）20-0001-10

Mechanism of Shengmaisan in Treating Type 2 Diabetes Mellitus with Coronary Heart Disease

Based on Network Pharmacology and SPR Assay

CHEN Moliang1，WANG Xiaozhen2，XU Guanghui1，2，LI Zhijin1

（1.Xiamen Health and Medical Big Data Center/Xiamen Medicine Research Institute/Xiamen Key Laboratory of Natural Medicine Research and Development，Xiamen 361008，Fujian，China;

2.College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，Fujian，China）

Abstract：Objective To explore the mechanism of Shengmaisan on the treatment of type 2 diabetes mellitus （T2DM） with coronary heart disease （CHD）.Methods The TCMSP， BATMAN-TCM and Uniprot databases were used to retrieve the active components and corresponding targets of Shengmaisan. The Genecards， Drugbank and TTD databases were used to retrieve the target genes of T2 DM and CHD. The Venny2.1.0 tool was used to obtain the disease intersection targets. Cytoscape 3.9.1 software was used to establish a network map of active substances-components-targets. The PPI network was constructed by STRING， and the top 10 key target genes were obtained. GO function and KEGG pathway analysis were performed through the R voice ClusterProfiler package， and molecular docking was completed using Discovery Studio software. Finally， the SPR assay experiment was completed.Results There were 207 effective components in Shengmai Powder， corresponding to 1643 related targets. There were 2663 T2DM disease targets， 1206 CHD disease targets， and 337 disease-drug intersection targets. Finally， three key targets were obtained： AKT1， CTNNB1， ESR1; GO and KEGG analysis found that the biological pathways involved mainly include MAPK， AGE-RAGE， TNF and other signaling pathways; the above results were subjected to molecular docking， and AKT1 protein and related active ingredients were selected to complete the surface plasmon resonance SPR binding detection， and the binding results showed that all of them had good activity.Conclusion Shengmaisan may play a role in the treatment of T2DM complicated with CHD from the aspects of multi-component， multi-target and multi-channel regulation of glucose and lipid metabolism， improvement of oxidative stress， etc.

Key words：Type 2 diabetes mellitus;Coronary heart disease;Shengmaisan;Network pharmacology;SPR assay

糖尿病（diabetes mellitus， DM）已经成为继肿瘤之后对人类生命健康造成严重威胁的慢性非传染病，预计到2040年，全球将约有6.4亿糖尿病患者，而在我国目前糖尿病发病率高达12%，给患者和家庭带来巨大的医疗负担[1-3]。DM主要是由胰岛素抵挡或胰岛素分泌不足引起的，而2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是糖尿病的主要类型，占糖尿病患者的90%～95%，是目前全球流行的疾病之一，发病率越来越高[4]。且T2DM作为心脏、血管、眼睛、肾脏和神经系统等疾病的危险因素，不可避免地增加死亡风险和社会医疗负担。研究表明[5， 6]，T2DM患者发生心血管疾病（cardiovascular disease， CVD）的风险是非T2DM患者的2～6倍，这表明了T2DM与心血管疾病之间存在强关联。心血管疾病主要包括冠心病（coronary heart disease， CHD）、脑卒中、心力衰竭等，CHD是指心脏冠状动脉血管变得狭窄或阻塞，即出现了动脉粥样硬化病变，导致心肌缺血，从而引起心绞痛、心肌梗死等症状的一种心血管疾病，是我国居民死亡的主要病因之一[7]。DM患者的血糖水平与CHD密切相关，长期患DM的患者会对包括心脏在内的多个器官和系统造成伤害，引发大血管和微血管并发症[8-11]。目前，两种疾病均无完全根治之法，仅能控制病情。研究表明[12， 13]，患有T2DM的患者合并CHD的风险是非患有T2DM的患者的2～4倍，因此T2DM的死亡率大幅增加。现代临床西医主要使GiuPsLxhYKyU3/oAq31Wnw==用降血糖药物、降压药、改善血脂和动脉介入等手段来治疗T2DM合并CHD[14]，但这些方法普遍存在药物依赖性强、副作用等问题，导致临床疗效不佳。近年来，中医药在治疗T2DM、CHD等方面取得了重大进展，在这类疾病上以其整体观、辨证论治、中药多靶点的作用，体现其独特的治疗优势，可达到标本兼治的效果，显示出良好的前景。生脉散是由人参、麦冬、五味子三味中药组成的传统中医方剂。现代临床研究表明[15-17]，生脉散具有多种功能，包括扩张冠脉和增强心肌收缩力、提高心肌耐氧量等能力，可以用于治疗CHD、心绞痛等心血管疾病。此外，生脉散还具有降血糖、调脂、改善血管微循环等作用，在DM、高血脂等疾病的治疗中也有较好的效果[18， 19]，其临床应用价值广泛。但由于中药复方各药物之间的复杂性和多样性，中药及复方治疗疾病的具体作用机制尚不明确。近年来，由于疾病、药物有关的数据不断增多，以及计算机技术、分析软件的不断改进，使得网络药理学在中医药研究领域的应用日益广泛，并逐渐成为中医药研究热点[20， 21]。利用网络药理学技术对生脉散治疗疾病的具体作用机制进行的研究已经越来越多，其在T2DM、CHD等领域也已取得了一定成果[22-25]，但目前生脉散同时治疗T2DM和CHD两种紧密关联的疾病研究较少[26， 27]。本研究基于网络药理学和SPR实验检测，探索生脉散治疗T2DM合并CHD的作用机制，以期为其在临床上的运用提供理论依据，提高其在临床上的应用价值，现报道如下。

1材料与方法

1.1网络药理学方法

1.1.1筛选生脉散有效成分及靶点预测 在TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）筛选生脉散活性成分，其中TCMSP数据库设置筛选参数口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和生物利用度（drug-likeness， DL）≥0.18。BATMAN-TCM数据库设置筛选参数未Score cutoff≥20及P-value cutoff<0.05。将两个数据库所得到的生脉散活性成分以及相关蛋白靶点合并去重。使用Uniprot数据库将蛋白靶点名称标准化。

1.1.2糖尿病和冠心病疾病靶点预测 根据T2DM和CHD两类疾病，利用关键词“type 2 diabetes mellitus”和“coronary heart disease”在Genecards（https：//www.genecards.org/ds）、Drugbank（https：//go.Drugbank.com/）和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库中检索，将结果合并去重获得T2DM和CHD疾病相关靶点。其中，在Genecards数据库中设置相关性得分≥20进行筛选。利用Venny2.1.0在线绘图工具，将已获得的生脉散药物靶点与T2DM、CHD疾病靶点绘制韦恩图，取交集获得生脉散干预T2DM合并CHD的潜在靶点基因。

1.1.3构建药物-成分-靶点网络图 使用Cytoscape 3.9.1软件（http：//www.cytoscape.org），构建“药物-活性成分-共有靶点基因”关系网络。该网络中包含药物、成分和靶点节点，通过边表示药物-成分、成分-靶点之间的相互关系，并基于网节点络度值进行筛选前10个的活性成分节点。度值表示网络中节点连线的数量，节点度值越大，说明其参与作用越强。

1.1.4构建蛋白质互作PPI网络 将筛选的生脉散与T2DM合并CHD的共有靶点基因导入STRING数据库（https：//www.string-db.org/），选择“Multiple Proteins”，且物种选定为“Homo sapiens”，设置置信度分数（highest confidence）大于0.9，并去除游离节点，其余参数均为默认值，构建蛋白质相互作用PPI网络图，并以此PPI网络为基础，根据网络中节点度值获得排名前10的关键靶点基因;另外，利用Cytoscape 3.9.1软件插件cytohubba，根据最大集团中心度（maximal clique centrality，MCC）值筛选出前10的靶点基因节点，两者取交集后得到潜在治疗T2DM合并CHD的关键靶点基因。

1.1.5 GO富集分析和KEGG通路富集 利用R语言中ClusterProfiler包对生脉散与T2DM合并CHD的共有核心靶点基因进行GO和KEGG富集分析，设定P值<0.05。GO分析主要包括生物过程（biological process， BP）、细胞成分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF），以此来分析靶点主要是通过何种信号通路和生物功能调控T2DM和CHD。

1.1.6分子对接 根据上述分析结果，筛选得到核心成分及靶点基因，将药效成分作为配体，核心靶点作为对接位点完成分子对接。分子对接主要分为3个步骤：①准备靶点蛋白结构：利用蛋白质PDB结构数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白PDB文件，再运用Discovery Studio软件将蛋白去除结晶水、加氢，并对蛋白进行几何结构优化。②准备小分子化合物：小分子化合物的二维结构从TCMSP数据库、PubChem数据库中获得，TCMSP数据库可直接获得化合物的mol2文件，但由于部分化合物TCMSP数据库中没有收录，需从PubChem数据库中获得化合物的sdf文件，再通过OpenBabel软件转换成mol2文件，最后再利用Discovery Studio软件对核心化合物成分进行加氢、能量最低化等优化处理。③分子对接：采用Discovery Studio软件中的Dock Ligands（LibDock）进行分子对接，以验证上述流程得到的结论。

1.2 SPR亲和力检测实验步骤和方法

1.2.1材料和仪器 样品：通过分子对接结果，选择结合效果较好的蛋白和小分子化合物进行SPR亲和力检测实验。材料仪器：CM5芯片（厂家：Cytiva，货号：BR100530，批号：10329008），氨基偶联试剂盒（厂家：Cytiva，货号：BR100050，批号：31206），10 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）（厂家：Cytiva，货号：BR100349，批号：31483），自制的PBS+（10×）pH7.4，DMSO（厂家：Sigma，货号：D4540-1L，批号：BCCG1271）。

1.2.2 实验方法 ①试剂准备：配制PBS（10×）缓冲液母液（20 mmol/L KH2PO4，1.37 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2HPO4，27 mmol/L KCl，pH7.4），用超纯水将PBS母液稀释10倍，pH调节至7.4，作为运行缓冲液（2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，pH7.4），0.22 μmol/L滤膜过滤后使用。氨基偶联试剂盒，包含：115 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS），750 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10.5 ml 1 mol/L乙醇胺（pH 8.5）。将每管EDC和NHS分别加入10 ml去离子水，分装保存到-18 ℃至更低温度，并在2个月内用完。②芯片准备：将配体蛋白以10 mmol/L醋酸钠（pH 4.0） 稀释至11.7 μg/ml。首先，在10 μl/min的流速下，用400 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS激活CM5芯片表面480 s。接下来，以10 μl/min的流速在实验通道（Fc）中多次加入11.7 μg/ml的配体蛋白，固定量约1000 RU。最后，使用1 mol/L乙醇胺将芯片进行封闭，封闭时间为480 s，流速为10 μl/min。参比通道（Fc1）与实验通道（Fc2）进行相同的操作。③亲和力测定：ⓐ配制5% DMSO-PBS作为运行缓冲液2 （2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，5% DMSO，pH 7.4）;ⓑ配制不同DMSO浓度的溶剂校准品，见表1;ⓒ先用DMSO将分析物溶解成10 mmol/L母液，再使用PBS（10×）及超纯水将分析物配制成500 μmol/L，缓冲液组分与运行缓冲液2保持一致（2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，5% DMSO，pH7.4），将稀释后的分析物，在60 s内，以30 μl/min的流速分别注入实验通道（Fc2）与参比通道（Fc1），并在60 s内进行解离，结合解离步骤均在运行缓冲液2中进行。

2结果

2.1生脉散潜在活性成分和靶点筛选 两个数据库有效成分并集后去重，其中人参122个、五味子76个、麦冬18个，最终三味药材合并去重，得到生脉散的有效成分共207个，有效成分对应的靶点基因1643个，见表2。

2.2疾病靶点筛选 通过Genecards、Drugbank和TTD三个数据库中筛选到的结果合并再删除重复靶点，得到T2DM相关靶点2663个，CHD相关靶点1206个，见表3。将生脉散有效成分的1643个作用靶点与T2DM、CHD相关靶点取交集绘制韦恩图，得到共有交集靶点基因337个，可认为是生脉散治疗T2DM合并CHD的潜在靶标基因集，见图1。

2.3构建药物-成分-靶点网络图 将所获得的生脉散有效成分、对应疾病靶点基因导入Cytoscape3.9.1软件中，得到“药物-活性成分-作用靶点”网络，网络共有546个节点（3个药物节点、106个成分节点和337个交集基因节点）和2464条边，其中节点平均度值为9.02。通过筛选网络中节点度值大于平均度值的节点，最终绘制“药物-活性成分-作用靶点”网络图，见图2。根据网络中节点度值，筛选排名前10的生脉散有效成分，分别是维生素B1（Vitamin B1）、长叶烯（Longifolene）、月桂烯（Myrcene）、牛磺酸素（Tauremisin）、五味子酚[（+）-Gomisin K3]、去氧哈林通碱（Deoxyharringtonine）、麦芽糖（Maltose）、山奈酚（Kaempferol）、20（R）-人参皂苷Rg3[20（R）-Ginsenoside Rg3]、戈米辛L2[（-）-Gomisin L2]，见表4。

2.4构建PPI网络 将生脉散与T2DM合并CHD的337个共同靶点基因导入STRING数据库，进行蛋白质相互作用PPI的网络分析，可视化结果见图3。根据PPI网络中节点度值，筛选排名前10的关键靶点，另外使用Cytoscape3.9.1软件中cytoHubba插件的MCC算法获取前10的关键靶点，见表5;两种算法结果取交集后得到3个关键靶点，即AKT1、CTNNB1、ESR1，这些靶点基因可能是和生脉散治疗T2DM合并CHD的关键靶点。

2.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析 通过R语言中clusterProfiler包，对337个共同靶点基因进行信号通路富集分析。GO富集分析结果根据P值排序，分别筛选出BP、CC和MF中富集显著的前10个生物学功能，其中BP包括对外界刺激的反应、创伤修复、氧气水平调节、细菌源分子的反应、肌肉系统过程、脂多糖作用、上皮细胞增殖、氧含量降低的反应和血液循环的调节等;CC包括膜微区、膜筏、神经元细胞体、囊腔、细胞质囊泡腔、内质网膜、质膜筏、阳离子通道配合物、小窝胞膜以及肌纤维膜等;MF包括受体激活活性、受体配体活性、DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、四吡咯结合、生长因子活性、跨膜转运蛋白结合、血红素结合、类固醇结合等，见图4。KEGG通路富集得到191条结果，根据P值和基因数量选取前20的通路进行分析，发现生脉散治疗T2DM合并CHD的途径包括多种显著富集的信号通路，如糖尿病并发症中的AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1信号通路和脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化等，表明生脉散治疗T2DM合并CHD可能涉及代谢、凋亡等多方面信号通路的影响，见图5。

2.6分子对接分析 利用Discovery Studio软件进行蛋白质和小分子化合物的计算机模拟对接，对接结果得到绝对自由能、相对自由能、对接姿式数和LibDockScore综合分数。将从药物-成分-靶点网络图中筛选出的度值排名前10的化学成分与3个关键靶点进行分子对接，结果显示20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose与AKT1、CTNNB1、ESR1均有较好活性，见表6。生脉散中的4种活性化合物[20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose]与T2DM合并CHD的3个核心靶点（AKT1、CTNNB1、ESR1）通过静电作用、氢键、范德华力、π-π相互作用等分子间作用力很好地结合，形成稳定的结构，具体结果见图6。基于分子对接结果推测该研究可能通过作用于上述几种关键靶点发挥治疗T2DM合并CHD的作用，同时阐明了生脉散调控T2DM合并CHD具有“多成分、多靶点、多通路”的机制特点。

2.7 SPR亲和力检测

2.7.1实验样品选择 基于分子对接结果，选取AKT1蛋白进行SPR实验验证，由于小分子化合物Deoxyharringtonine有毒性，目前无市售，因此选择购买Maltose、（20R）-Ginsenoside Rg3、Kaempferol这三种小分子化合物。蛋白：AKT1（厂家：义翘神州，目录编号：10763-H08B）;小分子化合物：Maltose （厂家：上海源叶，货号：B20834-20mg）、（20R）-Ginsenoside Rg3 （厂家：MCE，货号：HY-N1376）、Kaempferol（厂家：上海源叶，货号：B21126-20mg）。

2.7.2实验结果 ①AKT1蛋白偶联结果：配体偶联量约为12 000 RU。②化合物单浓度筛选结果：使用分析软件Biacore T200 Evaluation Software对不同分析物结合信号进行标准化处理，检测得到3种化合物的结合散点图，筛选得到结合值大于cutoff的化合物有2个，即Kaempferol和（20R）-Ginsenoside Rg3，见图7;通过分析物与配体结合传感图，发现以上2个小分子化合物解离速度都较快，见图8。从传感图可知，Kaempferol与AKT1蛋白结合要高于（20R）-Ginsenoside Rg3与AKT1结合，与AKT1有明显结合信号。

3讨论

中医疗法注重扬长避短，毒副作用小，辨证论治与整体观念独具特色，使得中医药在治疗T2DM合并CHD上发挥了强大的作用。但中药复方各药物之间的药效机制较复杂，难证实中药复方中的活性成分通过多途径、多环节、多靶点来治疗疾病[2]。因此，本研究运用网络药理学对生脉散干预T2DM合并CHD的药效物质基础及可能作用的靶点和通路进行了深入研究，并对其可能作用机制进行初步探讨，发现生脉散中的多个药效物质不仅可以对一个靶点发挥作用，也可对多个靶点发挥作用，表现其多途径的协同增效作用。

本研究筛选了生脉散106个复方成分，药物疾病共同作用靶点337个，通过分析得到可能起治疗作用的核心化合物有维生素B1（Vitamin B1）、长叶烯（Longifolene）、月桂烯（Myrcene）、牛磺酸素（Tauremisin）、五味子酚[（+）-Gomisin K3]、去氧哈林通碱（Deoxyharringtonine）、麦芽糖（Maltose）、山奈酚（Kaempferol）、20（R）-人参皂苷Rg3[20（R）-Ginsenoside Rg3]、戈米辛L2[（-）-Gomisin L2]，通过作用于RAC-ɑ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、儿茶素β-1（CTNNB1）、雌激素受体（ESR1）等关键靶点，根据调控MAPK信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、脂质与动脉粥样硬化等多个途径，来调节血糖血脂水平，改善氧化应激等，从而对T2DM合并CHD进行干预。网络药理学与我国中医药学中的系统整体观和辨证论治理念不谋而合，将其运用到中医药研究可为疾病的控制和用药提供更多选择和可能性，也为中药复方新药的研发及医学现代化发展提供技术支持[23]。

基于网络药理学的分析结果，本研究采用了分子对接技术，选取生脉散中的4种活性化合物[20（R）-Ginsenoside Rg3、Deoxyharringtonine、Kaempferol、Maltose]与T2DM合并CHD的3个核心靶点（AKT1、CTNNB1、ESR1）完成分子对接，根据绝对自由能、相对自由能、对接姿式数和LibDockScore综合分数这几个参数来评估成分与蛋白质靶标的亲和程度，结果均显示对接成功。基于分子对接的结果，本研究另通过SPR亲和力检测实验，使用Biacore T200检测AKT1蛋白与分析物Maltose、（20R）-Ginsenoside Rg3、Kaempferol的结合情况，根据分析物与配体结合信号散点图所示，在运行缓冲液2稀释分析物时，Maltose和（20R）-Ginsenoside Rg3在200 μmol/L时可溶，Maltose与AKT1无明显结合信号，（20R）-Ginsenoside Rg3与AKT1结合信号较弱;Kaempferol在25 μmol/L时可溶，与AKT1有明显结合信号。分析物与配体结合传感图得知，Kaempferol和（20R）-Ginsenoside Rg3的解离速度都较快，通过比较响应值可知，Kaempferol与AKT1蛋白结合要高于（20R）-Ginsenoside Rg3与AKT1结合。

综上所述，本研究初步探讨了生脉散治疗T2DM合并CHD的作用机制，为阐述中药方剂生脉散治疗T2DM合并CHD的作用机制提供了重要数据，即通过生脉散中的多种活性成分介导T2DM及CHD相关的多靶点、多通路来发挥作用，实现“靶标-受体-配体-复合物-靶标-受体”的相互作用和作用机制的可视化，对网络药理学方法得出结果的精确性进行验证，从而揭示生脉散治疗T2DM合并CHD的药效基础，为后续的细胞及动物实验研究提供思路和参考依据，为临床提供理论依据。

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编辑/杜帆

基金项目：厦门市医疗卫生指导性项目（编号：3502Z20214ZD1304）

作者简介：陈沫良（1988.8-），男，湖南武冈人，博士，助理研究员，主要从事计算生物、中医药数据挖掘研究