NaCl胁迫下‘心文41号’核桃的生理响应及耐盐基因表达

摘要：[目的]旨在研究不同NaCl胁迫条件下‘心文41号’（Juglans cordiformis ‘Xinwen No．41’）核桃幼苗的生理特性及离子转运、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联信号基因表达的响应差异。[方法]采取盆栽控盐的方法，选择长势一致的‘心文41号’核桃幼苗作为试验对象，设置100、150、200 mmol．L-13个NaCl浓度进行处理，同时以清水作为对照组（CK）。经过20 d的胁迫处理，对幼苗的表型、光合等指标进行了测定，通过非损伤微测技术（NMT）评估了根系Na+、K+、H+通量。提取叶片和根部的RNA测定MAPK级联信号传导和离子转运相关基因的表达。通过冗余分析（RDA）探究了生理指标与基因表达之间的相关性，旨在揭示心形核桃幼苗对盐胁迫调节机制的反应特征。[结果]随着NaCl浓度增加，心形核桃幼苗的根系体积和总生物量显著减少，叶片出现枯黄和萎蔫现象。光合生理参数（净光合速率、蒸腾速率和气孔导度）呈下降趋势，胞间C02浓度逐渐增加。叶片和根系中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，脯氨酸（Pro），丙二醛（MDA）和过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）含量均出现不同程度的增加，根系中Na、含量显著积累，随盐浓度增加其外排趋势明显，叶片中K、外排和H、内流以维持胞内渗透势的稳态。耐盐相关基因质膜Na、／H、逆向转运体（Salt Overly Sensitive，SOS1）在叶片表达量高于根系，液泡膜Na、／H、逆向转运体1（NHXl）呈先上调后下调的趋势，且液泡H+-ATPase c亚基（VHA-C1）在根系中显著上调。在100 mmol·L-1NaCl浓度胁迫下，WRKY65（WRKY transcription factor 65）、MKK9（Mitogen-activated protein kinase kinase 9）和MPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因的表达呈上升趋势，且叶片中的表达量显著高于根系。[结论]NaCl胁迫条件下，心形核桃根系受胁迫影响大于叶片，JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2与抗盐能力密切相关，是作为抵御盐胁迫的关键基因。

关键词：心形核桃；NaCl胁迫；基因表达；非损伤微测技术；冗余分析

中图分类号：S722;S727.32 文献标识码：A 文章编号：1001-1498（2024）05-0105-11

土壤盐渍化作为重要的非生物因素，影响了全球近20%的耕地和1/3的灌溉地区。我国盐渍土主要集中于西北的干旱和半干旱地区、华北和东部沿海地区，严重制约着农林业生产、经营和可持续发展。NaCl胁迫初期通过渗透调节抑制植物生长，随后导致离子失衡和氧化压力加剧，从而抑制植物的生长发育。

为应对NaCl胁迫，植物进化出一系列适应机制，包括离子转运调节、渗透调节和抗氧化系统的调节。通常耐盐品种的根中Na+浓度较低，K+高于盐敏品种，且大量元素在叶和茎积累，证明耐盐品种有更强的离子传输能力。Na+（K+）／H+逆向转运体分别是定位在质膜和液泡膜的跨膜蛋白，其中质膜定位的Na+／H+逆向转运体盐过度敏感蛋白（SOSl）属于NHX型Na+（K+）／H+交换家族；NHXs作为液泡膜中Na+/H+逆向转运体，将过量的Na、从细胞质转移到液泡中贮存；VHA-c作为V-ATPase亚基与NHX2异位共表达可促进K+的吸收，在棉花（Gossypium hirsutum L．）、香蕉（Musa nana L）中均发现SOS1、NHX1基因在盐胁迫下显著表达，有助于维持离子稳态的内部机制；向日葵（Helianthus annuus.L）中NHX2与VHA-c1基因在盐胁迫下异位共表达可促进水稻（Oryza sativa.L）的生长。此外，通过积累Pro和可溶性蛋白（Soluble protein，sp）等物质能够调节NaCl胁迫的渗透失衡。植物防御系统的关键酶APX、POD、SOD作为线粒体和叶绿体的主要产物，能减轻ROS产生导致的氧化应激。MAPK级联途径在植物逆境响应的调控方面发挥关键作用，H2O2可作为信号分子触发级联反应，提高了抗氧化酶的活性。MAPK接收MAPKK磷酸化传递的信号，进入细胞核与TFs相互作用可调控下游基因的表达，直接或间接调控WRKY转录因子，显著增强了抗逆性并减轻氧化胁迫。在拟南芥（Arabidopsis thaliana.L）中发现盐胁迫下MPK3和MKK9基因上调在盐胁迫响应中发挥作用；烟草（Nicotiana．L）中WRKY65基因过表达增强耐盐性。冗余分析可用来探究生理参数与基因之间的相关性，从而对植株耐盐性的主要调控基因进行预测，在桉树（Eucalyptusspp.）中应用了这一方法。

核桃是重要的坚果和木本粮油树种，是我国战略经济林种，在山区农民扶贫中发挥着关键作用。但在盐胁迫导致核桃生理病害，产量下降，经济损失严重。因此，培育抗盐碱能力强的核桃砧木品种是有效利用和改良盐碱地资源的主要手段。心形核桃（Juglans cordiformis Max.）属于胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans），于20世纪30年代引入我国，作为抗性砧木具有广泛的应用前景。然而目前研究多集中于核桃的抗旱和抗寒机制，对耐盐机制研究较少，且心形核桃的研究未见报道。为改善中国核桃砧木单一的现状，本实验选取心形核桃后代‘心文41号’（Juglans cordiformis‘Xinwen No.41’）作为试验材料，通过盆栽控盐的方法探究幼苗响应NaCl胁迫的生理机制，并结合耐盐基因的表达分析，旨在为筛选核桃耐盐砧木提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料与盐处理

‘心文41号’核桃选自辽宁特色经济林育种国家长期科研基地。2022年4月中旬，经过3个月层积催芽处理的种子播种在含有泥炭土：蛭石：珍珠岩混合物（v：v：v=3：1：1）的花盆中（直径18 cm，高25 cm）。待幼苗长至45 d时，即平均株高达30 cm、平均地径4.7 mm、平均复叶4对时，选择长势一致的幼苗分为4个NaCl浓度梯度0（CK）、100、150、200 mmol·L-1进行处理，每个处理3组，每组6株。盐溶液分3次添加：6月19日、6月21日和6月25日，每次浇300 mL，总计900 mL。在每个盆的底部放置一个托盘，将流出的溶液倒回盆中以保证盐分固定。在处理后第20 d，采集植株中上部复叶第2对功能叶，进行叶片形态指标、生理指标和荧光定量的测定，采集6条一级侧根进行除相对含水量和光合参数外的指标测定，并于-80℃冰箱中保存。

1.2 形态指标的测定

总生物量（W总）的测定：采集植株的根系和叶片洗净，于105℃杀青15 min，80℃烘干至质量恒定，分别测定地上部干质量（Stem dryweight，WS）和地下部干质量（Root dry weight，WR）及根冠比（Root/Stem，R/S）；采用排水法测定根系体积（Root volume，VR）；最长侧根长（Longest lateral root length，LLR）：在平整桌面放置托盘，倒入少量水保持浅水层，将根在水中拉直，记录最长侧根的长度。

W总＝WR+WS；根冠比（R/S）=WR/WS

1.3 生理指标的测定

相对含水量（Leaf Relative water content，LRWC）使用饱和称重法测定；使用高分辨冷场发射扫描电镜（Regulus 8230，日本日立）参考杨国一的方法扫描叶片内表皮气孔，用ImageJ测量气孔长（SL） /μm、宽（SW）／μm、气孔孔径（SW/SL）。

采用硫代巴比妥酸显色法测定MDA；用索莱宝试剂盒（BC3595）测定H2O2含量；Pro含量测定参考酸性茚三酮比色法；采用氮蓝四唑比色法（NBT法）测定SOD活性；采用愈创木酚法测定POD活性；APX活性测定参考的方法，使用火焰分光光度计法测定叶片和根系中K+、Na+的含量。

使用Li-6400 XT（Ll-COR，Lincoln，NE）测量净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和胞间CO2浓度（Ci）。所有测量均在晴天上午进行（9：00-11：30）。

1.4 NMT测定根系中Na+、K+和H+流速

使用非损伤微测技术（NMT）检测（BIO-OO1A3，美国扬格科技公司）根尖部位的Na+、K+和H+流速，具体检测参考Chen的方法，将幼苗的根系用蒸馏水清洗3次，每个根固定在小培养皿中间，在含有0.1 mmol·L-1 NaCl，0.5 mmol·L-1KCl， 0.2 mmol·L-1 CaC12和0.1 mmol·L-1 MgCl2，pH 5.7的测试液中平衡30 min，将电极靠近根表，测定距根尖500 μm的分生区流速变化，并记录5 min内离子的稳定流速。

1.5 内参基因筛选和实时逆转录聚合酶链反应分析

本研究使用的参考基因组版本为Juglans_regia．xhhuanglab_v1 .O.genome.fa，共筛选出8个基因，其中4个与离子转运体相关的基因JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2、JrVHA-c1，4个与MAPK级联信号相关的基因JrWRKY48、JrWRKY65、JrMKK9、JrMPK3，探究其在根系和叶片中的表达情况。使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天源生物科技（北京）有限公司）提取RNA，用TaKaRa（RR037Q）试剂盒反转录成cDNA。使用Primer3.0 Plus软件为单个基因设计特异引物，以JrGADPH为内参基因，计算每个基因的相对表达量。转录本的定量采用2-△△Cr法，每个处理4次重复，引物见表1。

1.6 数据分析

使用Graphpad Prism 8.0和Excel 2019绘制表格和数据。使用IBM SPSS Statistics 26软件对生理指标进行显著性分析，统计分析前对数据进行方差齐性检验，对不满足的数据进行转换以满足方差齐性的标准，p＜0.05被认为是显著，图片编辑使用Adobe Photoshop2023软件，使用Canoc05软件进行RDA图的绘制。

2 结果

2.1 NaCl胁迫对心形核桃幼苗形态及生长指标的观察和测定

在100 mmol·L-1盐处理时幼苗下部叶片表现出黄化和边缘焦枯，当NaCl浓度为150 mmol·L-1时，其叶片黄化卷曲程度进一步加深，200 mmol·L-1时有持续的脱落现象（图1），说明不同NaCl浓度持续诱导了幼苗胁迫损伤，且随着浓度的增加，其症状更为明显。

随着盐浓度增加，幼苗的R/S呈下降的趋势，与CK相比，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1处理与CK相比降低了1.54%和10.77%。当盐浓度达到200 mmol·L-1时，与CK相比，其R/S、LRWC、/LR、VR、W总总分别降低了10.77%、19.72%、31 .06%、50.80%、71 .54%（表2）。

2.2 NaCl胁迫对心形核桃幼苗光合作用的影响

幼苗的气孔整体呈现松散不规则排列，随着胁迫浓度的增加，其表面气孔结构的破坏更严重（图2A）。对气孔形态定量分析，与CK相比，200 mmol·L-1时气孔长（SL）上升了20.96%，而气孔宽（SW）显著下降了19.15%（图2B、C）。当NaCl浓度大于100 mmol·L-1，气孔孔径（SW/SL）显著下降，200 mmol·L-1时与CK相比降低了31 .33%（图2D）。

随着NaCl胁迫加剧，幼苗的Pn，Tr，Gs均呈下降的趋势，在150 mmol·L-1盐处理下与CK相比分别下降了50.89%、44.26%、50.00%（图2E～G），而C；持续升高，200 mmol·L-1时较CK增加70.0%，差异显著（图2H）。与CK相比，盐浓度显著抑制了SPAD值，经100、150、200 mmol·L-1盐处理的SPAD值分别下降了23.35%、46.88%、62.62%（图21）。

2.3 NaCl胁迫对心形核桃幼苗渗透调节物、脂质过氧化产物及抗氧化酶的影响

叶片Pro含量在100 mmol·L-1盐处理时达到峰值，与CK相比增加了76.17%；根中Pro含量在200 mmol·L-1时与CK相比增加了129.92%．差异显著（图3A）。200 mmol·L-1盐处理时叶片中MDA含量达到最大值，与CK相比增加了37.27%；100 mmol·L-1处理时根中MDA含量达到最大值，与CK相比增加了51 .43%（图3B）；叶片中的H202含量在盐浓度200 mmol·L-1时与CK相比增加了72.02%；在根中则随盐浓度增加显著上升，100、150、200 mmol·L-1时增加了65.56%、93.8g%、138.86%（图3C）。叶片中SOD活性在150 mmol·L-1时到达最大值，与CK相比增加了62.44%；而根中SOD活性在100、150、200 mmol·L-1盐处理时较CK相比增加了23.05%、35.80%、39.51%（图3D）；POD活性和APX活性在根中积累量均低于叶片（图3E、F）。

2.4 NaCl胁迫对心形核桃幼苗根系Na+、K+、H+流速的影响

NaCl胁迫时Na、流向表现为外排，在100mmol·L-1盐处理时Na、净流量介于35.61～624.33nmol·m-2·s-1，随盐浓度增加，其净流量呈上升趋势（图4A）。在200 mmol·L-1 NaCl胁迫时Na+平均净流量达到1 007.98 nmol·m-2·s-1，较CK显著增加了3 140.05%（图4B）。K+流向表现为外排趋势，随盐浓度增加，K+净流量的上升趋势低于Na+。在200 mmol·L-1时其净流量达到最大，介于577.3～989.5 nmol·m-2·s-1（图4C）；100、150、200 mmol·L-1盐处理时K+平均净流量较CK相比分别增加了228.62%、457.25%、685.87%（图4D）。

随着盐浓度增加，H+内流趋势更加明显。200 mmol·L-1时净流量达到最大，介于-9.62～-7.19 nmol·m-2·s-1（图4E），150、200 mmol·L-1时与CK相比分别增加了925.58%、1 532.25%（图4F）。

2.5 NaCl胁迫对心形核桃幼苗根系和叶片中Na+，K+含量及分布的影响

随着盐浓度增加，Na+含量在根系中显著增加，100、150、200 mmol·L-1时与CK相比分别增加了163.7g%、243.74%、475.70%；在叶片中呈先升高后下降的趋势，150 mmol·L-1时达到峰值，较CK增加了345.80%（图5A）。叶片中的K、含量显著高于根系，叶片中K+含量在150 mmol·L-1时达到最大值，与CK相比增加了43.67%。而根系的K+含量变化幅度较小，100、150、200 mmol·L-1处理时与CK相比分别降低了4.46%，1.50%．3.00%（图5B）。此外，NaCl胁迫下根系和叶片中K+/Na、比值显著降低，叶片中100、150、200 mmol·L-1盐处理时相较CK下降了55.89%、64.85%、53.41%，根系较CK分别降低了63.89%、75.08%、83.10%（图5C）。综上所述，根系中Na+积累量高于叶片，而K．和K+/Na+低于叶片。

2.6 NaCl胁迫下心形核桃幼苗生理指标的相关性

结果发现，叶片SW/SL与Gs、Tr呈显著正相关；SPAD与POD呈显著负相关；Pn与SOD、POD、APX活性、MDA呈负相关；K+/Na+与Na+含量、POD活性、Ci呈负相关（图6A）。根中生理指标的相关性得出，LLR、VR与Pro、MDA、H2O2含量呈显著负相关；Na+平均速率与K+平均速率呈显著正相关，H+平均速率与POD活性呈显著负相关（图6B）。

2.7 NaCl胁迫对心形核桃幼苗离子转运及MAPK级联信号相关基因表达模式

结果发现，JrSOS1基因在叶片中表达量随盐浓度增加呈先升后降的趋势，100 mmol·L-1处理时达到峰值，与CK相比增加了39.17%；根系中150mmol·L-1时表达量最高，较CK增加了170.76%（图7A）。Jr～HX1基因在根系中100 mmol·L-1盐处理时差异显著，与CK相比增加了499.30%（图7B）。JrNHX2基因在100 mmol·L-1时叶片和根系中表达量均显著增加，与CK相比分别增加了470.40%，70.19%（图7C）。JrVHA-c1在报系中受到显著诱导，100、150、200 mmol·L-1时较CK增加了465.83%，442.86%，131.87%（图7D）。

根系中JrWRKY48基因在150 mmol·L-1时达到显著水平，与CK相比增加了59.06%：叶片中表达量随盐浓度增加呈上升趋势，200 mmol·L-1处理时较CK增加了101.13%（图7E）。JrWRKY65基因在叶片中100 mmol·L-1时受到显著诱导，与CK相比增加了78.24%；根中在150 mmol·L-1时表达量最高，较CK增加了174.42%（图7F）；叶片中JrMKK9基因在150 mmol·L-1处理时达到峰值，与CK相比增加了317.60%（图7G）；JrMPK3基因在200 mmol·L-1时表达量最大，较CK增加1478.32%（图7H）。

2.8 MAPK信号级联及离子转运调控基因与生理指标的冗余分析

利用冗余分析（RDA）探究基因与生理指标的关系，发现叶片中K+/Na+和JrVHA-c1基因显著正相关，基因JrSOS1与SW/SL、Pn、Tr显著正相关（图8A）;繇中JrSOS1、JrMKK9和JrWRKY48基因是影响Na+和K+平均流速的主要基因（图8B），且与H+平均流速、VR、R/S高度负相关。此外，JrVHA-c1和JrMPK3基因分别通过调控叶片的Gs和抗氧化系统来提高耐盐性（图8A），而JrWRKY65和JrMKK9基因调控根系的MDA和H2O2含量提高耐盐性，以上基因分别在叶片和根中的RDA1轴有最长的投影长度。

3 讨论

植物受到盐胁迫时会造成植物失水，生物量可以直接反映植物受盐胁迫的损伤程度，可作为盐胁迫特征的可靠指标。本研究发现，随着NaCl浓度增加，W总、LLR、 VR均显著降低，表明盐胁迫造成植株根系吸收水分受阻，抑制了根系的生长发育。高盐胁迫显著降低了东部黑核桃（JuglansNigraL.）、接骨木（Sambucus canadensisL.的LRWC，而在本实验中，100 mmol·L-1处理下核桃幼苗的LRWC呈上升趋势，随后下降，植株叶片能承受一定的盐浓度，增强吸收和储存水分，然而可溶性盐分的持续增加减少了对水分和营养物质的吸收，阻碍了植物与水分间的平衡关系。Pn的下降受气孔和非气孔因素的影响，低盐胁迫下的气孔特性作为Pn值下降的主导因素。本研究中，SW、SW/SL、Gs随NaCl浓度增加显著下降，而Ci显著上升，表明盐环境下气孔的关闭减缓了水分的散失，但这一作用影响了CO2吸收和同化的效率，减慢了光合进程从而抑制植株的生长；相关性分析表明，Pn与Tr和Gs呈显著正相关，可见盐胁迫下气孔因素是影响Pn下降的主要原因，在开心果砧木（Pistacia vera L．）中也证实了这一点。

盐胁迫会导致ROS的大量积累，阻碍电子传递导致氧化应激，伴随膜脂过氧化产物MDA的产生。本研究中，随NaCl浓度的增加，幼苗根系中积累的MDA含量高于叶片，根系作为直接接触盐分的部位，产生过量的ROS使根系细胞膜的通透性增大，而叶片ROS的清除更为及时，在裸果木（Gymnocarpos przewalskii Maxim.）中也表现出类似的趋势。盐胁迫下植物体内抗氧化酶活性的高低可反映植物抵御逆境的能力，SOD作为清除ROS的第一道防线，POD和APX共同作为清除ROS的第二道防线将H2O2维持在较低水平。本研究中，随NaCl浓度的增加叶片中SOD、POD、APX活性均高于根系，叶片进行光合作用等过程虽产生大量ROS，但仍具有较强的抗氧化性能，而根系长期接触土壤盐分造成细胞氧化损伤严重，这与真红树种（True mangrove）的研究结果一致。

植物会启动多种防御反应如将Na+从根中排出，以及Na+区隔化于液泡中等多个策略。本研究中，根系积累的Na+含量显著高于叶片，表明幼苗的根系对Na+有一定的屏障作用，可以减少对地上部分的损害，保证叶片进行正常的生理活动和养分吸收，这与胡杨（Populus euphratica Oliv.）的研究结果一致。K+在维持阴阳离子的平衡之间起关键作用。本研究发现，叶片中K+含量随NaCl浓度增加呈先上升后下降的趋势，而根系中K+外排速率增加，低盐浓度幼苗根系仍具有较强的转运K+的能力；而随着NaCl浓度的增加，幼苗转运K．能力减慢，这与白柳（Salix a/ba L．）中的研究结果一致。SOS1能将过量的Na+排出细胞，NHXs能将过量的Na+逆浓度梯度运至液泡中，以维持细胞内的离子稳态。本研究发现，盐胁迫下叶片中JrSOS1基因的表达量显著增加且高于根系，表明JrSOS1基因将叶片细胞质膜中过量的Na+区隔化，减轻离子毒害。JrNHX1和JrNHX2基因在根系中显著上调，表明NHXs基因主要在根系中发挥作用，将过量的Na+泵入到液泡中，诱发了外向型K+通道，引起K+外排，这与JIANG XY等人的研究结果一致。NaCI胁迫下JrWRKY65基因在叶片中高度表达，同时与叶片Pro含量和JrSOS1基因高度相关，这表明JrWRKY65基因可能通过渗透调节以及维持Na+、H+稳态提高叶片的耐盐性，在酸枣中WRKY65基因也发挥相似的功能。

4 结论

本研究以‘心文41号’核桃作为试验材料，对NaCl胁迫条件下不同组织部位的生理变化及耐盐基因的表达进行分析。结果表明，盐胁迫抑制了气孔开度以及光合生理参数，从而减慢了光合进程，同时显著抑制了根系的生长。这一过程加剧了氧化应激，使细胞膜透性增大，产生过量的MDA和H2O2等过氧化产物。而叶片相较根系具有较强的抗氧化性能以维持ROS的清除过程。结合盐胁迫后不同组织部位中调控离子转运体及MAPK级联信号相关基因的表达情况，发现根系主要通过介导液泡NHXs基因上调促进Na+的外排和H+的内流，而叶片主要通过介导质膜SOS1基因促进Na+外排，同时保证K+的吸收来提高幼苗的耐盐性。这一结果为心形核桃NaCl胁迫调控机制解析和耐NaCl核桃砧木的筛选提供参考。

（责任编辑：张研）

基金项目：国家重点研发计划课题（2022YFD2200402）国家级