全红杨与2025杨抗锈性差异比较

摘要：[目的]为明确红叶杨品种全红杨与其亲本2025杨对叶锈病的抗性差异及其作用机制。[方法]通过在红叶杨品种全红杨和其亲本2025杨上人工接种北美栅锈菌，对两种杨树的发病状况、锈菌基因表达量、活性氧和抗氧化酶活性的动态变化进行了测定。[结果]表明两种杨树对北美栅锈菌均表现为感病，其中全红杨为中度感病，2025杨为高度感病。相比全红杨，锈菌在2025杨叶片内发育更快、潜育期更短、夏孢子堆更大更密。全红杨的3种抗氧化酶活性（POD、CAT、SOD）均高于2025杨，而2025杨中的活性氧水平高于全红杨。[结论]说明全红杨应对锈菌入侵较2025杨能更快的启动免疫应答反应，平衡活性氧水平，从而表现出较强的抗病性。

关键词：红叶杨；北美栅锈菌；抗锈性

中图分类号：S763.15 文献标识码：A 文章编号：1001-1498（2024）05-0178-08

杨树（Populus spp.）是我国分布广泛，具有重要经济价值的木材资源。美洲黑杨（Populusdeltoides W．Bartram ex Marshall）原产于北美洲，20世纪70年代我国引进种植，现已成为我国商业化杨树的主栽品种和杂交育种亲本。红叶杨品种“全红杨”（P．deltoids cv.‘Quanhong’）是2000年春由1棵美洲黑杨“2025”（P.deltoides cv．‘Zhonglin 2025’）平茬苗上发现的一个紫红色芽经过两次芽变育种而来，该品种的培育填补了杨树彩叶品种的空白。转录组数据表明，许多与花青素合成相关结构基因表达量的上调使全红杨叶片呈现鲜艳的紫红色，使该品种具备更高的观赏价值，因此在园林绿化、景观布局中发挥了重要作用。

由栅锈菌属（Melampsora）真菌引起的杨树叶锈病为杨树重要病害之一。大量锈菌寄生于杨树叶部，严重影响杨树光合作用，导致寄主树势衰弱，进而诱发其他病虫害侵染，可造成杨树干重减轻2g%～32%，材积损失31 %～42%。美洲黑杨及其欧美杨杂交种对国内普遍流行的杨树叶锈病菌（M. larici-populina Kleb.）分别表现为免疫和中抗状态，但近年来，北美栅锈菌（Melampsoramedusae Thum）入侵导致美州杨及其杂交种发病严重，并在国内广泛传播，对杨树产业和国土生态安全造成了不良影响。

相比2025杨，红叶杨田间发病轻而且晚，大多出现在10月初期；而2025杨发病大多出现在9月初期，其幼叶也呈紫红色，通常不发病。为分析二者抗锈性差异，本研究选择广泛栽培的红叶杨品种“全红杨”为研究对象，以其亲本2025杨为对照，通过人工接种M. medusae后，统计锈菌发病率，采用化学组织染色法观察叶肉组织内锈菌的侵染进程以及结合qRT-PCR技术测定锈菌的基因表达量，测定杨树叶片的活性氧含量和防御酶活性等生理指标的变化等方法，探究红叶杨和2025杨对叶锈病的抗性差异和机制，以期为杨树彩叶品种抗锈性育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

全红杨（Populus. deltoids cv.‘Quanhong’，简称QHY）和2025杨（P．deltoides cv.‘Zhonglin 2025’，简称L2025）1年生苗木购自河南商丘中兴苗木有限公司，培养于温室，相对湿度50%～60%，温度25℃。

北美栅锈菌（M. medusae，简称mmd）单孢子株系采自陕西省宝鸡市麟游县，由西北农林科技大学林学院森林病理实验室保存。

1.2 夏孢子接种和病情指数测定

参考沈阔型9）的方法进行人工接种，利用太白杨（P．purdomii Rehd）扩繁锈菌并收集夏孢子，制备终浓度为1 × 106 cfu·mL-1的孢子悬浮液，均匀喷施至健康生长的1年生全红杨和2025杨的叶片上，至叶片有水滴流下，均选择叶间隔期指数（LPI，leaf Plastochron index） 5～8的叶片，

以喷施等量无菌水为对照，每个树种接种5株，每株接种3个叶片，置于黑暗条件下保湿24 h后解除黑暗，转为常规培养，相对湿度50%～60%，温度25℃。每天观察叶片发病情况，接种8d后统计孢子堆密度，确定寄主反应型，每个处理15个重复。寄主反应型分级标准参考曹支敏等的方法，见表1。

1.3 侵染叶片的组织学染色

参考朱书生等的方法稍作改动：取接种锈菌的红叶杨与2025杨叶片，剪成1 cm × 1 cm大小的15个方形叶盘置于50 mL离心管中。首先在离心管内加入20 mL 100 g·L-1 KOH溶液至完全浸泡叶片，90℃水浴5 min，后用无菌水冲洗干净；而后加入20 mL 30% H202溶液漂白5 min，后用无菌水冲洗叶表；最后加乳酸于室温下酸化5 min。加入苯胺蓝染液避光染色3～5 min，染色结束后用无菌水清洗叶片表面，清洗后将叶片浸泡人乳酸甘油（1：1）中，室温脱色12 h。用显微镜观察其菌落的染色情况并统计染色区域面积，计算锈菌侵入率：P=（m／M）×100%，式中：P为锈菌侵入率，m为视野内深色区域面积，M为显微镜观察时视野总面积。

1.4 小麦胚芽凝集素（WGA-Alexa 488）荧光染色

锈菌发育过程的染色参考庄华的方法稍作改动：采用1.2的方法对两种杨树接种锈菌夏孢子，在接种后24、48、96、168 h分别采集叶片样本，放置于固定透明液（乙醇：冰醋酸体积比=1：1）进行脱色，使叶盘绿色完全脱去；将透明过的叶盘用50%的乙醇冲洗1次后蒸馏水漂洗3次，弃去蒸馏水，加入1.5 mL 1 mol·L-1 KOH，高温高压处理（121℃，103.4 kPa）5 min使叶片纤维组织变软，叶肉完全脱去；处理后的样品用蒸馏水漂洗并转入新的离心管中，加入10 mL50 mmol·L-1 Tris-HCI（pH=7.0～7.4）缓冲液，浸泡30 min，弃去缓冲液；用20 μg·mL-1的WGA-Alexa 488荧光染料避光染色2h以上，用蒸馏水漂洗3次后用50%甘油保存。处理后样品的在荧光显微镜（Olympus BX-53）下对病菌侵染结构及生长状况进行观察（激发光波长450～480 nm，发射光波长515 nm），每个处理15个重复。

1.5 叶肉中锈菌基因表达量测定

参考ZHENG等的方法，选取在锈菌中稳定表达的ITS区域序列设计特异性引物，采用1.2的方法对两种杨树接种锈菌夏孢子，于Oh（未接种）、24、48、96、168 h采集叶片进行实时荧光定量PCR反应。使用Primer软件设计两对特异性引物：ITS-Mmd-F/ITS-Mmd-R（目的基因）和Q-TUB-Fla-TUB-R（内参基因），引物序列见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用2-△△CT法进行相对表达量分析，每处理5个生物学重复I14l。

所用试剂有：植物总RNA提取试剂盒为Omega E.Z.N.A.Plant RNA Kit;反转录试剂盒Hifair@V one-step RT-gDNA digestion SuperMixfor qRT-PCR、实时荧光定量试剂Hieff UNICONRUniversal Blue qRT-PCR SYBR Green MasterMix均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。微量核酸蛋白质分析仪为NANODROP ONE；反应所用仪器为美国伯乐CFX connect。

1.6 生理指标测定

参考《植物生理学指导》。采用1.2的方法对两种杨树接种锈菌夏孢子，于Oh（未接种）、24、48、96、168 h采集叶片样品，锡纸包裹后放入液氮速冻，后转移至-80℃超低温冰箱待测。H202含量测定采用钛复合物测定法、02-含量测定采用羟胺氧化法、过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法、过氧化氢酶（CAT）活性利用H202的减少量表示，每处理5个生物学重复。

1.7 数据统计与分析

采用Microsoft Excel对试验数据进行统计整理，利用SPSS Statistics 22.0对数据进行分析，采用一元方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重范围检验进行组间的显著差异分析（p＜0.05），最后用Origin 2021进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 红叶杨与2025杨人工接种反应比较

室内接种后对两种杨树的潜育期、孢子堆密度和病情指数进行调查统计，见表3。结果发现接种锈菌后，两种杨树均未出现褪绿或过敏性坏死反应；全红杨在第7天发病，而2025杨在第6天发病，全红杨发病速度慢于2025杨；全红杨产孢量较少，每平方厘米叶片上约12.6个孢子堆，夏孢子堆中等大小，多散生（图1a）；而2025杨产孢量多，每平方厘米叶片上约29.2个孢子堆，夏孢子堆大而密（图1b），常连接成片。参考表1的反应型分级标准，全红杨表现为中感反应（4级），2025杨则表现为高感反应（5级）。苯胺蓝染色结果表明，接种7天后，全红杨叶肉组织中蓝色菌体结构明显少于2025杨。统计染色区域侵染率结果表明，全红杨中锈菌侵染率（14.8%）低于2025杨（26.3%）。全红杨比2025杨发病更轻，表现为推迟发病、孢子堆密度小以及侵染率低。

2.2 北美栅锈菌在红叶杨和2025杨中侵染过程比较

为进一步了解锈菌夏孢子侵染全红杨和2025杨的过程和特征，对侵染不同阶段的叶肉组织内的锈菌菌体结构进行染色，显微观察如图2所示，锈菌夏孢子在杨树叶片表面萌发并产生芽管，并在接种1d （24h）后成功从叶片气孔入侵（图2a、e）；2d （48h）后锈菌开始在叶肉细胞内发育产生大量侵染菌丝并侵染邻近细胞（图2b、f）；接种4d （96 h）后菌丝大量繁殖（图2c、g）；2025杨在接种6d （144 h）后开始产孢，可以观察到夏孢子堆（图2d），而全红杨在接种7d （168d）后开始产孢（图2h）。锈菌在侵染前期在两种杨树中的侵染进程基本保持一致，但在2025杨中能更快产孢，且在发育过程中形成的菌丝团和孢子堆都较全红杨大、产孢量多。

2.3 叶肉组织中锈菌基因表达量比较

图3结果表明，接种锈菌后，随着时间的推移，锈菌在两种杨树叶肉细胞中的基因表达量均逐渐升高，2025杨中锈菌的基因表达量高于全红杨，且在接种锈菌后4 d（96 h）后到和第7d （168h）锈菌在2025杨中的表达量显著高于全红杨（p＜0.01），整体发育过程中，2025杨中表达量均高于全红杨，说明锈菌在2025杨叶肉组织内能够更快的发育繁殖。

2.4 红叶杨和2025杨对锈菌的抗氧化活性指标比较

2.4.1 接种锈菌后两种杨树活性氧含量的比较

测定两种杨树接种锈菌后的H2O2和O2-含量如图4所示，接种前（0h）健康植株中全红杨的H2O2和O2-含量均低于2025杨，接种锈菌后24 h内，全红杨中的H2O2含量迅速升高，而后趋于平缓；2025杨中接种前期H2O2含量未发生明显变化，24 h后开始升高，96 h达到峰值，而后开始下降。O2-含量在两种杨树感病过程中的变化趋势呈相反状态，全红杨中O2-含量在接种锈菌后开始下降，48 h后开始逐渐上升，96 h后大幅增长，而2025杨在接种前期02-含量升高，48 h开始下降。

2.4.2 接种锈菌后两种杨树抗氧化酶活性动态变化比较

测定两种杨树接种锈菌后的抗氧化酶活性结果如图5所示，接种前（0h）健康植株中全红杨的POD酶活性高于2025杨，接种锈菌后两种杨树的POD酶活性变化一致，均呈现先上升后下降的趋势，但红叶杨中的POD酶活性高于2025杨，接种病原24 h内，全红杨和2025杨POD酶活性均迅速升高，并在24 h达到峰值，24 h后开始下降，但全红杨中POD酶活性始终处于较高水平。全红杨中接种前（0 h） CAT酶活性低于2025杨，但二者的变化趋势总体一致，接种锈菌后24 h内两种杨树的CAT酶活性均开始上升，且全红杨涨幅高，在接种后24 h达到峰值，而后开始下降，在病程中期红叶杨中CAT酶活性高于2025杨。接种前（0h）健康植株中全红杨的SOD酶活性高于2025杨，接种锈菌后两种杨树中SOD酶活性变化趋势与POD酶相似，均呈现先升高后降低最后趋于平缓的趋势，两者均在接种后24 h达到峰值，而后开始下降，但全红杨中SOD活性始终高于2025杨，且在发病初期增幅更大。在整个病程中，全红杨的3种抗氧化酶活性总体水平均高于2025杨。

3 讨论

抗病性鉴定是抗病育种与植物资源评价工作的重要依据。本研究采用孢子悬液喷施活体植株对全红杨和2025杨的抗锈性进行了鉴定，表明两种杨树均为感病品种，但全红杨发病较轻，二者在表型上的差异主要表现在孢子堆密度、孢子堆大小方面，全红杨较2025杨发病更迟、夏孢子堆密度更小。

本研究两种染色结果显示，锈菌在2025杨中相较全红杨有更高的侵染率，成功入侵后能发育繁殖产生更多的侵染菌丝，产孢量也更高。对叶肉组织内的锈菌的基因表达量进行定量测定结果表明，锈菌入侵叶片后开始发育繁殖，在整体病程中呈现逐渐增加的趋势，而锈菌入侵后在2025杨叶肉组织内发育繁殖速度比全红杨中更快，这与Zheng等在太白杨中接种M. larici-populina的叶肉组织中菌体生物量变化趋势一致。锈菌入侵植物细胞后发育繁殖需要吸收寄主大量营养，然而前期研究表明全红杨中花青素含量远高于2025杨，而植物光合作用所需色素叶绿素a和叶绿素b均低于2025杨，这会严重影响全红杨的光合速率和能量积累，高苗琴等的研究也证实了这一点，因此全红杨中较低的营养水平可能也是制约锈菌在叶肉组织中发育繁殖速度的因素之一，这还有待进一步研究。

ROS是一系列化学性质活跃的氧化合物小分子的统称，其不仅是简单的毒性代谢产物，还可以作为信号分子参与植物体内的代谢活动，在植物免疫防卫反应中起着重要的作用。本研究发现，全红杨在接种初期H2O2含量增加，在侵染24 h后积累速度逐渐达到稳态；2025杨在病程中O2-含量始终保持较高水平，而全红杨中在接种初期就呈现下降趋势，与陈祖静等在美洲黑杨接种松-杨栅锈菌的抗性反应一致。在植物防卫病原物侵染的防御机制中，受病原菌的入侵寄主体内的ROS被激发，且有研究表明杨树品种的抗锈性越强，ROS升高幅度越大。锈菌入侵后，2025杨较全红杨具有更强的ROS积累能力，但二者均未出现ROS爆发的现象，且ROS积累量不足以引发细胞程序性死亡，感病叶片未出现褪绿反应。此外，正常状态下植物体内ROS水平处于稳定状态．受到病原菌侵染后，ROS大量积累，导致膜质过氧化损伤。全红杨感病前后O2-水平保持稳定，表明全红杨的抗氧化酶系统及高含量花青素类物质能更快平衡ROS水平，能防止细胞膜过氧化损伤，维持细胞稳态，因此，ROS水平不同可能也是造成全红杨与2025杨对锈菌感染出现差异的重要原因之一。

抗氧化系统是植物在长期进化过程中形成的活性氧平衡机制，SOD、POD和CAT等抗氧化酶可以清除病原物入侵后植物体内过多的ROS，有效防止细胞膜过氧化损伤，在抗病反应中起着关键作用。本研究中接种锈菌后，全红杨和2025杨的POD酶活性在整个病程中呈现先上升后下降的趋势，且全红杨在整个病程中的POD酶活性比2025杨高，这与抗、感种源青钱柳对炭疽病的抗性响应结果一致。且有研究表明，POD可以催化植物体内酚类物质的氧化，从而对病原菌产生毒害作用，抑制其生长繁殖，证明POD活性与植物抗病性呈现正相关。而SOD酶活性在病程中的变化趋势与POD酶活性基本一致，均随着锈菌侵染先上升后下降，SOD可以催化超氧阴离子对H2O2和O2的歧化，代表了植物防御ROS超标造成细胞膜过氧化的第一道防线。CAT活性在接种前2025杨较高，而接种病原后全红杨中CAT酶活性迅速升高，而后降低，这与抗性猕猴桃品种“徐香”对溃疡病的抗性响应结果一致，此外，在甘蔗感染黑穗病菌后的生理响应测定中发现，抗病基因型的CAT活性在接种前期涨幅高，而后期酶活性变化低于感病基因型，这说明CAT在对病原物的早期防御中发挥了一定的作用。综上，全红杨能在应对锈菌侵染时保持较高的抗氧化酶活性，且感病初期全红杨中抗氧化酶活性增长速率更快，这说明全红杨相较2025杨能够更快启动免疫应答反应，可有效防止ROS含量过高对细胞产生毒害作用。

4 结论

本研究从表型鉴定、组织化学染色以及生理生化指标等方面比较了全红杨和2025杨对北美栅锈菌的抗性差异，并对二者的抗病机制进行了测定、分析和讨论，发现二者产生抗性差异的主要原因可能有以下几点：全红杨较低的营养水平制约了锈菌在全红杨叶肉组织内的发育速度；全红杨能够在锈菌入侵后更快平衡ROS水平，维持细胞稳态；此外全红杨较2025杨有更高水平的抗氧化酶活性使其在应对锈菌入侵时能快启动免疫应答反应。但红叶杨抗病的分子机制及其与生理调控的内在联系尚未可知，这还有待进一步研究。未来可以采用转录组加代谢组的多组学联合分析手段，进一步明晰红叶杨抗锈病的内在机制，为病害防控和彩叶杨抗病育种提供参考。

（责任编辑：崔贝）

基金项目：国家自然科学基金（No.31670650）