吲哚乙酰化高直链玉米淀粉改善溃疡性结肠炎的作用机制研究

摘要：为了研究吲哚乙酰化高直链玉米淀粉改善溃疡性结肠炎的作用机制，利用葡聚糖硫酸钠诱导急性溃疡性结肠炎小鼠模型，采用吲哚乙酰化高直链玉米淀粉靶向结肠释放吲哚乙酸，结合芳香烃受体抑制剂，分析小鼠结肠长度、疾病活动指数，利用酶联免疫吸附法测定结肠白介素-6、白介素-10、转化生长因子β1、髓过氧化物酶和白介素-22等细胞因子的表达水平，采用定量聚合酶链反应分析结肠紧密连接蛋白occludin、ZO-1及CYP1A1的相对表达水平，并通过流式细胞术分析肠系膜淋巴结中调节性T细胞和辅助性T细胞17的比例。结果发现，吲哚乙酰化高直链玉米淀粉明显减轻结肠长度的缩短，显著降低疾病活动指数及白介素-6和髓过氧化物酶的表达，显著促进白介素-10、转化生长因子β1、白介素-22、CYP1A1、occludin和ZO-1的表达，明显提高调节性T细胞的比例，并显著降低辅助性T细胞17的比例，而给予芳香烃受体抑制剂会削弱吲哚乙酰化高直链玉米淀粉的作用。以上结果提示，吲哚乙酰化高直链玉米淀粉可通过激活芳香烃受体发挥改善溃疡性结肠炎的作用。

关键词：肠道菌群代谢产物；吲哚乙酸；溃疡性结肠炎；芳香烃受体；炎症反应；免疫平衡；色氨酸

中图分类号：R967文献标志码：A文章编号：1002-4026（2024）05-0017-08

开放科学（资源服务）标志码（OSID）：

Mechanism of action indole acetylated high-amylose

maize starch in improving ulcerative colitis

QU Xinyan1， LI Qingjun2， DING Xingchun1， SONG Yingying1*

（1. Shandong Analysis and Test Center， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China;

2. Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract∶The aim of this study is to investigate the mechanism action of indole acetylated high-amylose maize starch in improving ulcerative colitis. Dextran sulfate sodium salt was used to induce acute ulcerative colitis in mice. Indole acetylated high-amylose maize starch was then used to target the colon with the delivery of indole-3-acetic acid. This was combined with the administration of an aryl hydrocarbon receptor inhibitor to analyze the mice in terms of colon length; disease activity index; and levels of interleukin-6， interleukin-10， transforming growth factor β1， myeloperoxidase， and interleukin-22 in the colon， which were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the relative expression levels of the colonic tight junction proteins occludin， ZO-1， and CYP1A1. Flow cytometry was used to test the ratio of regulatory T cells and T helper 17 cells in the mesenteric lymph nodes. The results showed that administration of indole acetylated high-amylose maize starch significantly alleviated the shortening of the colon length; significantly reduced the disease activity index and the levels of interleukin-6 and myeloperoxidase; significantly promoted the expression of interleukin-10， transforming growth factor β1， interleukin-22， CYP1A1， occludin， and ZO-1; significantly increased the proportion of regulatory T cells; and significantly reduced the proportion of T helper 17 cells. Administration of the aryl hydrocarbon receptor inhibitor weakened the effect of indole acetylated high-amylose maize starch. These results together suggest that acetylated high-amylose maize starch can improve ulcerative colitis by activating aryl hydrocarbon receptors.

Key words∶microbiota metabolites; indole-3-acetic acid; ulcerative colitis; aryl hydrocarbon receptors; inflammatory response; immune balance; tryptophan

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要临床表现，累积结肠和直肠的非特异性炎症性肠病，被世界卫生组织定位为现代难治病之一，近年来我国UC发病率显著上升［1］。UC患者的肠道黏膜屏障损伤反复发作，肠壁的破坏与修复过程交替进行，病情严重者可出现肠穿孔、大出血、中毒性巨结肠甚至癌变等并发症，对患者、家庭及社会造成沉重的经济和精神负担［2-3］。目前，UC的治疗药物主要有氨基水杨酸类、糖皮质激素类和免疫抑制剂等。这些药物具有耐药性和费用昂贵等局限性，并且疗效和预后并不十分理想［4］。其中氨基水杨酸类药物只能缓解轻中度活动期UC患者的症状，其缓解率仅为50%；糖皮质激素类药物会给患者带来高血压、青光眼、骨质疏松等严重副作用；硫嘌呤类药物和钙调神经磷酸酶抑制剂等免疫抑制剂会引起肝肾损伤［5］。现已发现，肠道菌群代谢产物可以调节宿主的炎症反应，为UC治疗新策略的研究提供了新的思路和方法。

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是肠道菌群分解色氨酸生成的代谢产物。据报道，IAA可以通过直接中和自由基、诱导血红素氧化酶的表达发挥抗炎与抗氧化作用，IAA具有提高人源化胰腺导管腺癌小鼠模型化疗疗效的作用［6-7］，另外，IAA还可以促进白介素-22（IL-22）的表达，诱导抗菌肽REG3G的肠道表达，保护肠道屏障，抑制肠道细菌向肝脏转移，防止小鼠形成乙醇诱导的脂肪性肝炎［8］。近来研究发现姜黄多糖、壳寡糖或伏砖茶茶褐素可以通过调节色氨酸代谢，恢复包括IAA在内的色氨酸代谢产物的水平，明显改善溃疡性结肠炎小鼠的病理表型［9-11］。而且溃疡性结肠炎小鼠口服IAA后，病理表型也得到改善［12］。但是尚未有IAA改善溃疡性结肠炎作用机制的报道。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种重要的配体及活性转录因子，广泛表达于各种免疫或非免疫细胞中，在内源和环境信号的刺激下参与信号转导等重要的生物学过程，与多个免疫发育、分化、功能的关键信号通路均有密切联系［13-14］。肠道菌群代谢产物对机体免疫系统具有重要调节作用，包含IAA、吲哚丙酸在内的吲哚类化合物是AhR的配体，这些代谢产物对宿主肠道稳态具有重要作用［15-16］。本文主要从AhR信号通路入手，利用吲哚乙酰化高直链玉米淀粉（HAMSIAA）靶向结肠释放IAA，研究小鼠溃疡性结肠炎得以改善的机制，为UC治疗新策略的研究提供数据基础。

本文采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导急性溃疡性结肠炎小鼠模型，结合AhR抑制剂CH223191，测量小鼠结肠长度，计算小鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI），利用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分析结肠组织中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和白介素-22（interleukin-22，IL-22）等细胞因子的表达水平，采用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）法检测小鼠结肠组织中紧密连接蛋白occludin、ZO-1及AhR信号通路下游基因CYP1A1的相对表达水平，并通过流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结中调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和辅助性T细胞17（helper T cell 17，Th17）的比例，分析IAA改善溃疡性结肠炎的作用机制。

1实验仪器、材料及方法

1.1实验仪器

BD FACS Aria III流式细胞仪（美国BD公司）；Molecular Devices多功能酶标仪（美谷分子仪器（上海）有限公司）；Roche Light Cycler480 Ⅱ荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）；三重四极杆液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）。

1.2实验材料

实验动物（北京维通利华实验动物技术有限公司）；HAMSIAA（实验室自备）；DSS（美国MP Biomedicals公司，分子量=36～50 kDa）；CH223191（德国Merck公司）；IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-22和IL-17检测ELISA试剂盒（美国Invitrogen公司）；MPO（美国Rockland公司）；CD3、CD8a、CD25抗体（美国BioLegend公司）；Foxp3、B220、CD4抗体（美国BD公司）。动物实验方案经过山东省分析测试中心医学伦理委员会审查，审查批件号为ECAESDATC-2021-013。

1.3实验方法

1.3.1HAMSIAA的制备

采用缩合方法制备HAMSIAA，将高直链玉米淀粉加到二甲基亚砜（DMSO） 中，40 ℃搅拌至澄清，将反应液温度冷却至室温，然后依次加入IAA、缩合剂和１-甲基咪唑，继续搅拌24 h。反应结束后，将反应溶液缓慢地加到乙醇中，析出固体沉淀，除去溶剂，用乙醇洗涤沉淀3次，干燥沉淀得到HAMSIAA。

1.3.2分组与给药

将雌性小鼠C57BL/6（18～20 g）分成正常组（normal control）、模型组（DSS-only）、HAMSIAA和HAMSIAA+CH223191组，每组6只，HAMSIAA干预7 d后，将DSS按照2.5%的比例溶解到饮用水中，模型组、HAMSIAA和HAMSIAA+CH223191组动物自由饮用，连续饮用７ d，期间每天观察动物精神状态并称重。

1.3.3结肠长度和DAI值测定

实验结束后，收集小鼠结肠组织，测量其长度，并根据表1中的评分标准计算小鼠DAI值：

DAI值=体重下降评分+粪便黏度评分+粪便出血评分。

1.3.4UPLC-MS/MS法检测IAA含量

采集不同处理组小鼠的血清，取适量样本，加入内标IAA-d5 孵育30 min后，加入适量甲醇/水/甲酸混合液，超声提取，离心后过 Oasis HLB 柱萃取净化，经高效液相进行洗脱，采用电喷雾离子源（ESI），在正离子MRM（multiple reaction monitoring）模式进行采集，通过内标法进行定量。

1.3.5ELISA法检测细胞因子水平

取适量小鼠结肠组织样本，使用磷酸盐缓冲溶液按照1：9的比例研磨，研磨液经4℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书的操作方法，对IL-6、IL-10、TGF-β1、MPO、IL-17和IL-22等细胞因子表达水平进行测定。

1.3.6qPCR法检测基因相对表达水平

使用TRIzol法提取小鼠结肠中的总RNA，以GAPDH作为管家基因，利用SYBR green法检测occludin、ZO-1和CYP1A1等基因在不同处理组中的相对表达水平。GAPDH上游引物序列：CATCACTGCCACCCAGAAGACTG，GAPDH下游引物序列：ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG；occludin上游引物序列：TGGCAAGCGATCATACCCAGAG，occludin下游引物序列：CTGCCTGAAGTCATCCACACTC；ZO-1上游引物序列：GTTGGTACGGTGCCCTGAAAGA，ZO-1下游引物序列：GCTGACAGGTAGGACAGACGAT；CYP1A1上游引物序列：GACCCTTACAAGTATTTGGTCGT，CYP1A1下游引物序列：GGTATCCAGAGCCAGTAACCT。

1.3.7流式细胞术分析小鼠MLN中Treg和Th17细胞的比例

采集各组小鼠肠系膜淋巴结（mesenteric ymph nodes，MLN），制备淋巴细胞单细胞悬液。按照表2中的方案向获取的淋巴细胞中加入相应抗体进行孵育染色，而后利用流式细胞术分析各处理组Treg和Th17细胞的比例。

1.3.8统计学处理

使用8c3ee0ce38e6a2c1edd34028a76f7d14GraphPad Prism 9.00对数据进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示存在统计学意义。

2实验结果

2.1HAMSIAA改善小鼠结肠缩短程度及DAI评分

收集小鼠结肠并测量其长度，计算DAI评分。如图1所示，与正常组比较，模型组小鼠结肠长度明显缩短至（4.5±0.2） cm（P<0.001），且DAI值高达11.6±1.1（P<0.001）；而HAMSIAA可以显著减轻结肠长度的缩短（5.6±0.4） cm，（P<0.05）并降低DAI值至8.4±2.9（P<0.01）。HAMSIAA可以显著减轻结肠长度的缩短并降低小鼠疾病活动指数，给予CH223191会抑制HAMSIAA的作用。

2.2HAMSIAA增加小鼠血清中IAA的浓度

采集不同处理组小鼠的血清，加入内标IAA-d5孵育30 min后，加入甲醇/水/甲酸混合液，超声提取，离心后过Oasis HLB柱萃取净化，经高效液相进行洗脱，采用电喷雾离子源，在正离子MRM模式下进行采集，通过内标法进行定量。如图2所示，HAMSIAA干预能够明显增加小鼠体内IAA的浓度至（549.2±345.9）μmol/L。

2.3HAMSIAA改善小鼠结肠炎症损伤

炎性细胞因子包括IL-6、IL-17的上调是UC的一个明显特征，MPO在指示中性粒细胞浸润中起重要作用，而IL-10和TGF-β1与诱导Treg细胞抑制炎症反应密切相关。采用ELISA法检测小鼠结肠组织中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β1和MPO的表达水平。如图3所示，HAMSIAA可以显著降低IL-6、IL-17和MPO的表达水平至（2 447±909.0） pg/mL（P<0.01）、（708.3±339.2） pg/mL（P<0.05） 和（3 399 898±571 099） pg/mL（P<0.01），并显著促进IL-10和TGF-β1的表达水平至（68 185±15 512） pg/mL（P<0.05）和（673.4±106.3） pg/mL（P<0.05），给予CH223191会抑制HAMSIAA的作用。

2.4HAMSIAA减轻小鼠肠道屏障受损

在肠黏膜屏障功能的研究中，occludin和ZO-1是保持肠道黏膜屏障功能正常的重要组成部分，由occludin和ZO-1等维持的肠道黏膜屏障可以有效防止内毒素和肠道细菌移位。采用qPCR法检测小鼠结肠组织中的紧密连接蛋白occludin和ZO-1的mRNA表达水平。如图4所示，HAMSIAA可以显著促进occludin和ZO-1的相对表达水平，分别是0.371 9±0.225 9（P<0.05）和0.575 2±0.509 9（P<0.05），而给予CH223191干预抑制了occludin和ZO-1的相对表达，抑制了HAMSIAA的作用。

2.5HAMSIAA调节小鼠肠道免疫平衡

Treg细胞具有维持自身免疫耐受及抑制相关免疫反应过度活化的功能，其数量和功能对机体维持正常的免疫稳态至关重要，而Th17细胞在炎症性疾病的发病、发展和转归过程中扮演重要角色。采用流式细胞术分析小鼠MLN中Th17和Treg细胞的比例。如图5所示，HAMSIAA可以显著提高MLN中Treg细胞的比例至7.0±1.5（P<0.05），并显著降低MLN中Th17细胞的比例至0.3±0.2（P<0.05）。

2.6HAMSIAA促进AhR下游蛋白与基因的表达水平

激活AhR信号通路，会促进该信号通路下游CYP1A1和IL-22的表达，其中IL-22参与修复肠道黏膜屏障。采用ELISA法检测小鼠结肠组织中IL-22的表达水平，采用qPCR法检测小鼠结肠组织中CYP1A1的基因相对表达水平。如图6所示，HAMSIAA可以显著促进细胞因子IL-22的表达（927.4±334.9）pg/mL，P<0.05，并提高基因CYP1A1的相对表达至7.8±2.2，给予CH223191会抑制HAMSIAA的作用。

3讨论与结论

UC是一种威胁人类健康的疾病，传统的治疗方法会产生副作用，并带来巨大的经济负担。因此，迫切需要安全有效的新型药物。越来越多的证据表明，饮食、肠道微生物群及其代谢产物与UC密切相关［17］。芳香族氨基酸色氨酸对宿主健康起着至关重要的作用，高色氨酸摄入已被证明对许多疾病有益，包括UC［18］。IAA是肠道菌群分解色氨酸后生成的一种代谢产物，已被证实具有抗炎、抗氧化及辅助胰腺导管腺癌化疗等作用［6-8］。

IAA是非水溶性的，目前发表的文章一般是通过吲哚乙酸盐的形式来补充，而吲哚乙酸盐无法实现对结肠的靶向补充，且补充吲哚乙酸盐会大量摄入金属阳离子（如钠和钙），而本文中采用的HAMSIAA是一种抗性淀粉，摄入后可抵抗小肠消化，到达结肠部位后被肠道菌群发酵并大量释放IAA，补充效率高且避免了传统补充方式中存在的异味及金属阳离子的不利影响。

本文将HAMSIAA应用于DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型，肠道菌群分解HAMSIAA释放大量的IAA于肠道中，有利于减轻患病小鼠结肠缩短、降低小鼠DAI，而CH223191可抑制这种改善作用。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的促炎细胞因子IL-6、MPO表达水平显著升高，而抑炎细胞因子IL-10、TGF-β1表达水平明显降低，而HAMSIAA干预可以调节细胞因子水平失衡，促进抑炎细胞因子IL-10和TGF-β1的表达并抑制促炎细胞因子IL-6、MPO的表达。紧密连接蛋白对肠道屏障的完整性至关重要，它可以防止脂多糖等内毒素从肠腔渗漏。当包括occludin和ZO-1在内的紧密连接蛋白被破坏时，肠道屏障就会被破坏［19］。与正常组比较，模型组小鼠肠道组织中occludin和ZO-1的相对表达水平明显降低，而HAMSIAA干预能明显促进occludin和ZO-1的表达。机体免疫功能异常与UC密切相关，免疫系统中CD4+ T细胞的免疫失调在UC发病过程中起到关键作用。Treg细胞和Th17细胞是重要的CD4+ T细胞亚群，它们之间的协调平衡是维持机体免疫平衡的重要环节［20］。多项研究表明，Treg/Th17的失衡可能是UC发病的最直接和最重要的因素［21］。而HAMSIAA干预可以显著纠正患病小鼠MLN中的Treg/Th17失衡。HAMSIAA干预可以明显促进AhR下游CYP1A1基因的相对表达水平，同时明显增加AhR下游IL-22的分泌。而给予CH223191后，HAMSIAA的改善作用均被抑制。

综上可见，在小鼠急性溃疡性结肠炎模型中，HAMSIAA可以通过激活AhR信号通路降低结肠炎症反应，调节肠道Treg/Th17平衡，促进肠道损伤修复。

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