基于细胞膜色谱技术的鹿角胶肽段筛选及鉴定

摘要：利用细胞膜色谱/超高相液相色谱-质谱（CMC/UPLC-MS）方法对中药饮片鹿角胶中的有效成分进行筛选，结合Maxquant软件、Perseus软件以及Uniprot数据库对所得谱图进行数据分析，使用Protein Data Bank对分析结果进行结构鉴定，同时采用生物信息学平台对这些肽段的生物活性、不良反应、相对分子质量、等电点、不稳定指数等基本分子特性进行预测。鉴定肽段活性概率为0.09，无毒，无溶血性，有致敏性，相对分子质量为1 541.68，肽链长度为14，亲水性为良好，等电点值为3.92，不稳定性指数为34.39。该方法为快速筛选鉴定具有药理作用的多肽和蛋白质等活性成分提供了一条可行的研究思路。

关键词：鹿角胶；细胞膜色谱；骨髓间充质干细胞；白细胞介素-1β

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1002-4026（2024）05-0001-09

开放科学（资源服务）标志码（OSID）：

To explore the pharmacodynamic substance basis of Cervi Cornus Colla

based on cell membrane chromatography

SUN Tiefeng1， ZHAO Yu2，WANG Ping1*，DING Xianglong3，DING Lijun4，WANG Jinguo

4

（1.Shandong Academic of Chinese Medicine， Jinan 250014，China； 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，

Jinan 250355，China； 3.Huangdao District Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qingdao 266400，China；

4.Rizhao Traditional Chinese Medicine Hospital，Rizhao 276800，China）

Abstract∶Cell membrane chromatography/ultrahigh-phase liquid chromatography-mass spectrometry （CMC/UPLC-MS） was used to screen the active ingredients， i.e.， peptides， in the traditional Chinese medicine tablet Cervi cornus Colla， and the obtained spectra were analyzed using Maxquant software， Perseus software， and Uniprot database. Structures of these peptides were identified using Protein Data Bank， and their molecular properties such as their biological activity， adverse reactions， relative molecular mass， isoelectric point， and stability index were predicted using a bioinformatics platform. With an activity probability of 0.09， the peptides were identified as nontoxic， nonhemolytic， sensitizing， and highly hydrophilic， with a relative molecular mass of 1 541.68， a peptide chain length of 14， an isoelectric point of 3.92， and an instability index of 34.39.This method provides a feasible research approach for rapidly screening and identifying active ingredients（e.g.， peptides and proteins） that exhibit pharmacological effects.

Key words∶Cervi Cornus Colla；cell membrane chromatography；bone marrow mesenchymal stem cells；interleukin-1β

骨质疏松（ostcoporosis，OP）是一种全身性骨病，其病理学主要特征为骨代谢失衡导致的骨过度吸收。根据国家卫生健康委员会在2018年发布的中国骨质疏松症流行病学调查结果发现，我国40～49岁人群低骨量率达到32.9%［1］。因此找到一种有效促进软骨重建、修复受损软骨和恢复关节功能的治疗方案已经成为治疗OP亟待解决的问题。近年来，随着对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的深入研究，许多学者发现BMSCs在软骨重建、修复受损软骨和恢复关节功能上发挥了重要作用［2］。

在中医的藏象理论中，肾主骨生髓，肾藏精，精生髓，髓充骨，故目前多认为骨质疏松的中医核心病机为“肾精亏虚”。鹿角胶始载于《神农本草经》，其味甘、咸，性温，主归肝、肾经，具有补气血、益精髓、强筋骨等作用，可以用于治疗跌打损伤、肾气不足、虚劳羸瘦、腰痛等疾病。目前，针对鹿角胶有效成分分离纯化方法的研究主要集中在像离子交换色谱、凝胶色谱等分离纯化速度较慢的多维色谱上，而对能够直接筛选纯化中药活性成分的细胞膜色谱技术［3］的研究尚有欠缺，仍需研究人员深入探索。

现代研究发现，利用鹿角胶及其酶解产物可有效诱导BMSCs向成骨细胞分化［4-5］。因此本实验选取鹿角胶和BMSCs应用细胞膜色谱法，以期对鹿角胶促成骨化的药效物质进行快速筛选分离纯化鉴定。

1材料和方法

1.1材料

（1）细胞：骨髓间充质干细胞（赛业生物科技）。

（2）药材及主要试剂见表1。

（3）主要仪器见表2。

（4）研究涉及的数据库和软件见表3。

2方法

2.1样品制备

鹿角胶是将鹿角片加水煎煮、浓缩制成的固体状可食用胶。本研究鹿角片购于国药乐仁堂河北药业有限公司，经山东省中医药研究院中药资源研究室林慧彬研究员鉴定为正品，制备方法和鉴别方法按照2020年版《中华人民共和国药典》［6］“鹿角胶”项下进行。把鹿角片放在圆底烧瓶中，加入水煎煮两次，合并胶汁，用50 ℃真空减压浓缩，冷却到室温即为鹿角胶，采用辐射灭菌，4 ℃保存。取前期实验制备好的鹿角胶置高速万能粉碎机粉碎，过120目筛。精密称定鹿角胶粉末50 mg，放置25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容后，用超声提取15 min，蒸馏水补足失重［7］，即得鹿角胶水溶液（2 mg/mL）。

精密量取鹿角胶水溶液5 mL，用0.22 μm微孔滤膜滤过，缓慢上样，依次用10 mL水和10 mL乙腈洗脱［8］，收集洗脱液置于锥形瓶中。将洗脱液减压浓缩，分别用水和乙腈定容于5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得样品。

2.2BMSCs细胞膜色谱固定相的制备

用PBS把BMSCs（细胞浓度为4×107/mL）洗涤3次，而后在-20 ℃反复冻融3次，加10 mL PBS，用1 000 r/min离心10 min，得到细胞悬浮液，弃去沉淀。上清液在4 ℃下使用10 000 r/min离心20 min。把沉淀与5 mL PBS混合（1 mg/mL）后，涡旋5 min，成为细胞膜悬液。将5 mL细胞膜混悬液缓慢加入6 mL的C18固相萃取柱中，于4 ℃下孵育12 h后，混合物用5 mL PBS洗涤3次，即为CMC固定相［9］。对照组固定相为以5 mL PBS溶液缓缓加入C18色谱柱中，于4 ℃孵育12 h后，用5 mL PBS洗涤3次得到的混合物。

2.3UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS实验条件

2.3.1色谱条件

Water ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min，95%B；3 min，95%B；9 min，50%B；28 min，5%B；28.1 min，95%B；31 min，0%B），流速0.3 mL/min，进样量40 μL，柱温35 ℃。

2.3.2质谱条件

离子源为加热电喷雾离子源（HESI），扫描模式为一级质谱全扫描结合自动触发二级质谱扫描模式（FullMS/dd-MS2），扫描范围m/z 80～1 500，一级质谱分辨率70 000，二级质谱分辨率17 500，正离子模式毛细管电压3.8 kV，负离子模式毛细管电压3 kV，毛细管温度和气化温度均为350 ℃，鞘气和辅助气均为N2，鞘气流速和辅助气流速分别为45 arb和15 arb，高压环形离子导入装置电压（S-LensRFLevel）为55。阶梯碰撞能量20、40、60 eV。

2.4鹿角胶中肽段的鉴定

2.4.1软件分析

利用Xcalibur4.3（Thermo Fisher Scientific，USA）软件进行谱图分析。

2.4.2Maxquant参数设置

将Xcalibur产生的RAW原始数据使用Maxquant软件（版本2.4.0.0）搜库。以Uniprot数据库收录至马鹿和梅花鹿蛋白库Red deer（reviewed，32条序列，2023-05-05下载，全表见OSID科学数据与内容附表1）和Sika deer（reviewed，14条序列，2023-05-05下载，全表见OSID科学数据与内容附表2）为检索数据库，实验参数设置为No Fraction和Label free quantification，其他参数均为默认值［10］。

2.4.3Perseus参数设置

将Maxquant产生的proteinGroups.txt和peptides.txt数据使用Perseus软件（版本2.0.10.0）处理。过滤污染蛋白（potential contamiant）和unique peptide>1的蛋白，以期得到独立肽段［11］。

2.5鹿角胶肽段生物信息学分析

2.5.1鹿角胶肽段生物活性与不良反应预测

对具有潜在药理作用的多肽类和蛋白类药物进行生物活性与毒性预测，可以为研究节省时间和实验成本。通过在线网站PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）可以预测肽段的生物活性概率［12］。通过在线网站ToxIBTL（https：//server.wei-group.net/ToxIBTL/ProcessServlet）可以预测肽段毒性［13］。利用在线网站Hemopred（http：//codes.bio/hemopred/）可以对肽段进行溶血性预测［14］，利用在线网站Algpred2.0（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/submission.html）可以对肽段进行致敏性预测［15］。

2.5.2鹿角胶肽段基本分子特性预测

对具有潜在药理作用的肽段进行基本分子特性预测，可以为样品的提取分离纯化等实验研究提供可靠的参考意见。通过在线预测网站（https：//pepcalc.com-Peptide calculator）可以预测鉴定得到的肽段的水溶性。利用Expasy ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam）可以预测肽段的不稳定性指数及PI值［16］，还可以得到肽段的化学分子式。不稳定指数可以初步判断肽段在实验中稳定与否，结果小于40为稳定，结果大于40则可能不稳定。

3结果与分析

3.1鹿角胶中促成骨化活性成分的筛选和鉴定

3.1.1鹿角胶水溶液和乙腈溶液中肽段的鉴定

在正负离子模式下，鹿角胶水溶液和乙腈溶液的总离子流图见图1、图2，利用Maxquant鉴定谱图中的肽段，Maxquant鉴定所得肽段具体见表4。

使用Perseus去除常见Potential contaminant以及unique peptide>1的肽段后［17］，得到肽段GDTPTLQLEEVDPK，FDR在1%以下，鉴定可信度良好。经Uniprot数据库中已经过人工核验的马鹿和梅花鹿蛋白序列库鉴定该肽段属于蛋白P51745序列的一部分。除此之外，在未经过人工验证的马鹿和梅花鹿蛋白序列库中还发现了另一拥有该肽段的蛋白，其Protein ID为D5KXX5。肽段GDTPTLQLEEVDPK在蛋白P51745和D5KXX5上的序列信息见表5～6。经PDB蛋白质结构数据库鉴定P51745为白细胞介素-1β，而D5KXX5未得到鉴定结果。Perseus得到的肽段质谱图见图3。

3.2鹿角胶肽段生物信息学分析

3.2.1鹿角胶肽段生物活性、不良反应预测

鹿角胶肽段生物学信息见图4所示。通常情况下，在Peptide Ranker中得到的生物活性预测结果大于0.5时，表明该活性肽段具有生物活性的概率较高。鉴定得到的鹿角胶肽段的活性概率为0.09，毒性预测结果为non-toxic，溶血性预测结果为non-hemolytic，致敏性预测及结果为ALLERGEN。通过肽的生物活性预测结果可知该活性肽段的生物活性偏低，因此在研究鹿角胶肽段的药理作用时，可以通过氨基酸突变、修饰等方式提高该活性肽段的活性。不良反应预测结果则为鹿角胶肽段实验研究过程中的突发情况提供了参考。

3.2.2鹿角胶肽段基本分子特性预测

经Expasy ProtParam tool预测可知，肽段相对分子质量为1 541.68，肽链长度为14，与Maxquant分析结果基本一致。肽段亲水性为Good water solubility，水溶性良好；PI值为3.92，不稳定性指数为34.39。Gao等［18］人利用HPLC-MS/MS和MALDI-TOF MS在分子量和等电点方面鉴别了提取的416种蛋白质，发现分子量主要分布在10～200 kDa，PI分布在3.84～11.57之间的蛋白质在水中稳定性强，本实验结果符合其检测结论。因此在研究鹿角胶时，其潜在有效成分的提取可以采用超声辅助水溶液提取。

4讨论

动物药是中药的重要组成部分，其预防和治疗疾病的历史长达数千年。在治疗骨骼类疾病方面，现代研究发现大多数动物药主要有效成分为蛋白质类、多肽类和氨基酸等提取物［19-21］。关于动物药的研究思路主要是把通过分离纯化后得到的较为单一的成分进行鉴定和活性验证的传统研究思路。这种研究思路很大程度上忽视了中药多组分多靶点协同作用的中药药理学机制［22］，对研究以多肽和氨基酸等为主要药效物质的动物药来说，不仅耗时长而且实验结果往往差强人意。而细胞膜色谱技术作为一种基于活性细胞膜可特异性结合中药活性成分的技术，可以在体外动态的模拟药物与体内靶点之间的相互作用，非常贴合中药多成分多靶点的作用机制［23-26］。

鹿角胶是一种具有广泛药理作用的动物类中药。目前，在研究鹿角胶治疗与骨相关疾病的作用机制上有着显著的研究进展。有研究发现，它不仅能够促进BMSCs的成骨相关基因COLI、integrin-α2、integrin-α5以及integrin-β1的表达，还能够使其钙化结节和分化为成骨细胞的数量显著增加［27］。本研究以鹿角胶为例采用新的实验方法建立了BMSCs细胞膜色谱模型，联合超高效液相-质谱从鹿角胶水溶液中筛选促成骨化的药效物质基础［28］，并通过Maxquant和Perseus软件分析鉴定出其活性成分，同时采用生物学信息平台预测实验结果的生物活性、不良反应以及基本分子特性。证实鹿角胶中的多肽类活性成分与BMSCs细胞膜有亲和靶点，并为动物药中多肽类有效成分的筛选和进一步的开发研究提供一条可行的研究思路。最终鉴定得到的鹿角胶肽段数量相对太少，猜测原因可能与鹿角胶水溶液中的某些大分子蛋白和BMSCs细胞膜的生物亲和性有限相关。

随着动物药的开采利用，其资源日益稀缺，而动物药成分复杂多样，传统的分离纯化方法需要适合蛋白质、多糖、多肽等成分的理化性质，这种分离纯化方法耗费时间长、经济成本高且不能可靠地得到具有药理作用的生物活性成分，因此亟需找到一种可靠的分离纯化方法，加速动物药药效物质的研究，开发合成新药，从而缓解药用资源的稀缺［29-34］。细胞膜色谱作为一种利用分子和受体特异性结合的性质筛选具有药理作用的生物活性成分的技术，不仅经济成本低廉，还能大大提高中药有效成分筛选速度，并且对靶向性不明的动物药提供了一种可行的实验方案，也可促进中药多靶点多组分治疗作用机制深入阐释。

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