基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术的垂盆草化学成分表征与鉴定

摘要：建立超高效液相-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS），表征与鉴定垂盆草中的化学成分。采用Phenomenex Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，进样量为3.0 μL；选择电喷雾离子源，正、负离子模式扫描。根据化合物的保留时间、精确分子量、二级碎片离子、裂解规律及对照品比对进行化合物分析鉴定。结果显示，从垂盆草中共鉴定或初步推导出了53个化学成分，主要包括25种黄酮、12种Megastigmanes类化合物、11种有机酸、3种生物碱及2种其他化合物。其中有5种化合物与对照品比对获得鉴定，3种化合物目前未见报道。该研究建立的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS方法可快速且全面表征垂盆草的化学成分，为其质量控制及药效物质基础研究提供参考数据。

关键词：垂盆草；超高效液相-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法；化学成分；黄酮

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1002-4026（2024）05-0010-07

开放科学（资源服务）标志码（OSID）：

Characterization and identification of chemical constituents in

Sedum sarmentosum Bung based on UHPLC-Q-Exactive

Orbitrap-MS technology

ZHU Xinyi1， YANG Chunguo2，TIAN Haitao1，HOU Miao1，HAN Liwen3，DENG Zhipeng1*

（1.College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China; 2.Shandong Yifang

Pharmaceutical Co.， Ltd.，Linyi 253000， China; 3.College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences，Shandong

First Medical University （ Shandong Academy of Medical Sciences），Jinan 250117， China）

Abstract∶To develop an ultra-performance liquid chromatograpy-quadrupole electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）method for characterization and identification of chemical constituents in Sedum sarmentosum Bung.The separation was performed using a Phenomenex Kinetex C18 column（2.1 mm×100 mm， 2.6 μm） with a mobile phase comprising acetonitrile and water containing 0.1% formic acid via gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min;the injection volume was 3.0 μL.Mass spectrometry was performed in positive and negative ionization modes with electrospray ionization. The chemical constituents were characterized and identified based on retention time， precise molecular weight， fragment ions，and comparison with the reference substances.The results of this study showed that 53 compounds were characterized and identified in Sedum sarmentosum Bung， including 25 flavonoids， 12 megastigmanes，11 organic acids，3 alkaloids and 2 other compounds.Five of these compounds were identified via comparison with reference compounds， and three compounds may have not been reported from Sedum sarmentosum Bung.The UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS method proposed in this study can rapidly and comprehensively characterize the chemical constituents in Sedum sarmentosum Bung and provide a reference basis for the research on quality control and atherapeutic material basis of Sedum sarmentosum Bung.

Key words∶Sedum sarmentosum Bung;UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS;chemical constituents;flavonoids

垂盆草（Sedum sarmentosum Bung）又名卧茎景天、养鸡草、狗牙瓣等，味甘、淡，性微凉，是景天科多年生开花植物，新鲜或干燥全草入药，具利湿退黄，清热解毒效果，常用于治疗湿热黄疸、痈肿疮疡、小便不通、急慢性肝炎等症状［1-2］。现代药理学研究表明，其具有降酶保肝、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧化、抑制脂质积累、增强运动能力等作用［3］。临床上常用垂盆草颗粒、复方垂盆草胶囊、复方垂盆草糖浆等制剂治疗急、慢性肝炎，缓解肝炎引起的转氨酶升高［4-6］。此外，新鲜的垂盆草全草经碾碎后外敷可以用来治疗老年压疮［7］、带状孢疹［8］，我国西南地区少数民族还常用垂盆草治疗毒蛇咬伤、缓解水火烫伤等。

众所周知，中药化学成分复杂多样，其药效的发挥是化学成分综合作用的体现。目前，垂盆草的研究多集中在化学成分的分离与鉴定、含量测定以及药理等方面［9-14］。随着提取分离技术的不断提高，国内外研究人员陆续从垂盆草中分离鉴定出黄酮类、Megastigmanes类、生物碱类化合物等，其中黄酮类是其主要成分。王雪等［10］采用UPLC-MS/MS法同时测定了垂盆草中8种黄酮类化合物的含量，总黄酮是发挥垂盆草降酶保肝的主要活性成分。赵娜等［15］证实垂盆草总黄酮可降低自噬相关蛋白IC3蛋白表达，抑制JAK/STAT信号通路，进而对肝损伤有保护作用。本研究采用超高效液相-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）对垂盆草的化学成分进行快速分析表征与鉴定，为其药效物质基础的全面认识及多成分的快速定性定量分析提供依据。

1仪器与试剂

超高压液相串联Ultimate 3000-Q-Exactive高分辨质谱（Thermo Fisher Scientific，美国）；MS205DU电子分析天平（Mettler Toledo，德国）；KQ3200DE超声波清洗器（昆山舒美，中国）。

槲皮素（批号PCS-210921）、槲皮苷（批号PCS-210509）、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷（批号PCS-211109）、没食子酸（批号PCS-210710）对照品购自成都植标化纯生物技术有限公司；金丝桃苷（批号MUST-12122003）购于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Thermo Fisher，美国）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；垂盆草粉末（批号TE2205039）由山东一方制药有限公司提供。

2方法

2.1检测条件

2.1.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相组成：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～2.0 min，15% A；2.0～7.0 min，15%～20% A；7.0～9.0 min，20%～45% A；9.0～21.0 min，45% A；21.0～26.0 min，45%～80% A；26.0～26.5 min，80% A；26.5～26.6 min，80%～15% A（初始比例平衡5 min）；流速：0.3 mL/min；进样量：3.0 μL；柱温：35 ℃；自动进样器温度：4 ℃。

2.1.2质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，喷雾电压为3.5 kV，毛细管温度350 ℃，鞘气和辅助气均为高纯N2，体积流量分别为35、10 L/min。分辨率70 000进行全扫描，扫描范围m/z 100～1 500。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备

称定槲皮素、槲皮苷、山柰酚-3-α-阿拉伯糖、没食子酸、金丝桃苷对照品适量，加入甲醇溶解，制成质量浓度约为10 μg/mL混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备

精密称定垂盆草粉末适量，加入2 mL甲醇-水（体积比为50∶50），配制为2.0 mg/mL的垂盆草溶液，25 ℃下超声处理10 min，经0.22 μm滤膜过滤，收集续滤液进样分析。

2.3数据处理

通过CNKI（https：//www.cnki.net/）、PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）等平台，检索相关文献，建立垂盆草数据库，其包含化合物名称、分子式、精确分子量、结构式等基本信息。采用Thermo Scientific Xcalibur软件进行数据处理，结合所建立的化合物库，比对各成分的保留时间、精确m/z、碎片离子信息、推测MS/MS裂解规律并结合文献报道等表征垂盆草化学成分。

3结果

3.1成分鉴定

通过UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术对垂盆草中的化学成分进行定性分析，得正、负离子模式下总离子流色谱图（图1）。总共鉴定或推导出53种化合物，包括25种黄酮、12种Megastigmanes类化合物、11种有机酸、3种生物碱及2种其他化合物，53种化学成分信息详见OSID中开放科学数据与内容部分。

3.2质谱裂解规律分析

3.2.1黄酮类化合物质谱解析

在垂盆草中共鉴定或推导25个黄酮类化合物，包括化合物9、12、13、15、22、24～26、29、33、35、36、39～42、44～52，绝大部分在负离子模式下检出。其主要裂解方式是丢失中性分子，例如CO、CO2等以及RDA裂解重排、糖苷键断裂、糖环裂解等，以化合物25、26为例说明解析过程。

负离子模式下，化合物25产生准分子离子峰［M-H］-m/z 463.087 6，二级产生碎片m/z 300.026 2、m/z 271.024 0、m/z 255.029 1、m/z 243.028 4及m/z 151.001 9。推测其准分子离子［M-H］-发生裂解，以均裂的方式脱去1分子葡萄糖（-162 Da）产生碎片离子m/z 300.026 2（［M-2H-Glc］-）；其准分子离子［M-H］-发生裂解，以异裂的方式脱去1分子葡萄糖，脱去1分子CH2O，产生碎片离子m/z 271.024 0（［M-H-Glc-CH2O］-），继而脱去1分子CO（-28 Da）产生碎片离子m/z 243.028 4（［M-H-Glc-CH2O-CO］-）；m/z 255.029 1（［M-H-Glc-H2O-CO］-）由分子离子以异裂的方式脱去1分子葡萄糖，脱去1分子H2O和1分子CO所得；结合相关文献［16］，经对照品比对，鉴定该化合物为金丝桃苷，其裂解方式见图2。

负离子模式下，化合物26产生准分子离子峰［M-iUB8roM+nnDkBjnUxFXYmg==H］-m/z 447.092 4，二级产生碎片m/z 285.039 5、m/z 151.001 9、m/z 107.012 2。推测其准分子离子［M-H］-发生裂解，脱1分子葡萄糖（-162 Da）产生碎片离子m/z 285.039 5（［M-H-Glc］-），继续脱1分子C8H6O2产生碎片离子m/z 151.001 9（［M-H-Glc-C8H6O2］-）、进一步脱1分子CO2（-44 Da）产生碎片离子m/z 107.012 2（［M-H-Glc-C8H6O2-CO2］-），经查阅相关文献［17］，推测为木犀草苷，其裂解方式见图3。

3.2.2Megastigmanes类化合物质谱解析

垂盆草中共鉴定12种Megastigmanes类化合物质，包括化合物14、16～18、20、21、27、31、32、34、37、43，以37为例说明解析过程。负离子模式下，检测到m/z 553.285 2，推测为［M+HCOO］-，进一步裂解得到其准分子离子峰m/z 507.279 2［M-H］-，脱去1分子葡萄糖（-162 Da）产生碎片离子m/z 375.237 4 ，根据以上裂解方式，推测为sedumoside E3，裂解途径见图4。

3.2.3有机酸类化合物质谱解析

垂盆草中共鉴定11种机酸类化合物，包括化合物1、3、7、8、10、11、19、23、28、38、53。其主要裂解方式为脱CO、H2O、COOH等中性分子，以化合物7、23为例说明解析过程。负离子模式下，化合物7产生准分子离子峰［M-H］-m/z 169.012 7，脱去1分子CO2（-44 Da）得到m/z 125.022 7，经对照品比对和相关文献［18］，鉴定为没食子酸。负离子模式下，化合物23产生准分子离子峰［M-H］-m/z 193.049，脱去CH3自由基产生二级碎片m/z 178.025 7，进一步裂解脱去1分子CO2，产生碎片m/z 134.035 6，结合相关文献［19］，推测化合物23为阿魏酸，化合物7、23裂解途径见图5。

3.2.4生物碱类化合物质谱解析

在垂盆草中共鉴定3种生物碱类化合物，包括化合物2、4、6。化合物2在正离子模式下，检测到准分子离子峰［M+H］+m/z 158.152 9，脱去1分子H2O得到二级碎片［M+H-H2O］+m/z 140.142 5，进一步裂解脱去1分子C3H6，产生碎片离子［M+H-H2O-C3H6］+m/z 98.096 2，推测化合物2为N-甲基石榴皮碱。在正离子模式下，化合物6产生准分子离子峰［M+H］+m/z 144.138 3，同理脱去1分子H2O生成m/z 126.127 1，进一步脱去1分子C3H6生成m/z 84.080 8，推测为古豆醇碱，化合物2、6裂解途径见图6。

3.2.5其他类化合物质谱解析

除以上化合物，还从垂盆草中鉴定出化合物5（嘌呤类化合物）和化合物30（环酮类化合物）。

4讨论与结论

本研究首次采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术，在正、负离子模式下对垂盆草的化学成分进行定性分析，根据化合物的保留时间、精确分子量、碎片离子、裂解规律及对照品比对，共鉴定或推导出53个成分，主要包括黄酮、Megastigmanes、有机酸及生物碱等，其主要成分为黄酮类和Megastigmanes化合物。

黄酮类化合物是一种广泛存在于多种植物中的主要活性成分，以苷类的形式存在，也有的以游离形式存在。垂盆草中的黄酮类化合物具有多种药理活性，如降酶保肝、抗肿瘤和抗氧化等［13，20-21］。例如，本研究中所鉴定出的黄酮类化合物金丝桃苷对H2O2所致L02肝细胞损伤有极显著的保护作用，且呈浓度依赖性［22］；木犀草素可通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭与转移，阻滞肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡以及调控肿瘤细胞活性氧（ROS）水平等途径抑制肿瘤生长，从而抑制机体多种肿瘤的发生与发展，具有良好的抗肿瘤作用［23］；槲皮素可通过清除氧自由基、鳌合金属离子、抑制ox-LDL引起的氧化损伤，表达其抗氧化活性［24］。

国外研究人员从垂盆草中发现的一系列化合物，证实黄酮类成分具有保肝活性，还可抑制脂质积累，促进脂质代谢［25-28］。此外，本研究鉴定的sarmentoic acid化合物已被证实具有抗肝癌活性［29］。

本研究建立的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS方法可以快速且较全面地分析鉴定垂盆草的化学成分，为其质量控制及药效物质基础研究提供参考数据。然而，本研究依然存在一定的不足之处，如已报道的化合物未检测到，可能与样品前处理方法及LC-MS条件参数设置有关，后续仍需进一步优化检测条件，从而完成垂盆草化学成分的全面表征。

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