9味中药及中药联用对奶牛乳房炎病原菌金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果

摘要：金黄色葡萄球菌是一种主要的食源性病原体，该菌也是造成反刍动物乳房炎的主要致病菌。而奶牛乳房炎极大地影响着奶牛的健康以及乳制品质量，从而影响到畜牧业的发展。因此选择合适的方式治疗和预防奶牛乳房炎是至关重要的。本研究共纳入了9味中药，旨在选择出最高效的抑制致病菌的中药及中药复方来改善奶牛乳房炎多发以及难以治疗的现状。试验结果显示金银花、诃子、蒲公英、甘草及其中药复方在体外抑菌试验中对金黄色葡萄球菌的抑制效果较为理想。本研究为中药疗奶牛乳房炎方面提供了新的证据。中药及中药复方有望为治疗奶牛乳房炎提供新的有意义的研究方向。

关键词：中药；体外抑菌试验；奶牛乳房炎；金黄色葡萄球菌

我国为奶牛养殖大国，然而奶牛乳房炎一直困扰着养殖场。奶牛乳房炎是奶牛养殖过程中一种常见且多发的奶牛疾病，其发病率高并且不仅影响奶牛的产奶量还会导致奶制品质量下降，此外后续还会持续影响奶牛产奶后的发情周期，可能会导致奶牛的乳房出现永久性的损伤，造成损失[1]。奶牛乳房炎因其常见性和多发性严重影响我国奶牛养殖业的大力发展。

细菌感染是造成奶牛乳房炎的主要原因。根据先前的报道可知引起奶牛乳房炎的最主要的病原微生物是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌能产生毒素和酶类物质，导致乳腺组织炎症反应，因此其会引起奶牛乳房慢性感染并且金黄色葡萄球菌产生的毒素会对奶牛乳房造成不可逆的损伤，严重影响产奶量和乳品质[2]。因此，研究金黄色葡萄球菌在奶牛乳房炎中的发病作用并探索对其有效的抗菌药物对于改善奶牛乳房炎的多发病现状是十分重要的。

中药作为中国传统医药理论指导采集、炮制的药物在各方面都发挥着重要作用[3]。 中药具有来源广泛、不易产生耐药性、毒副作用小、无残留的特点，并且还可以作为潜在的抗菌药物被广泛应用于畜禽的疾病防控和治疗中[4]。本研究探究了9味常见的中草药以及其复方，采用体外试验的方法探究中药及其复方是否对药物病原菌金黄色葡萄球菌产生体外抑制反应。本研究旨在筛选更高效的抑菌中药来防止奶牛乳房炎，并对奶牛乳房炎的预防和治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1）试验菌株。本研究试验样品来自青岛市某养殖场患有乳房炎奶牛的奶样，采样后分离出金黄色葡萄球菌。

2）主要培养基与中药样品。本研究选择金银花、诃子、蒲公英、甘草、沙参、山药、黄连、艾叶、白芷等9味常见中药。上述中药均购自青岛晟和医药中药店（杏林堂店）；本实验用培养基购自赛默飞世尔科技中国有限公司。

3）试验仪器。DNP-9162-1A电热恒温培养箱（常州润华电器有限公司）；电子天平 XPR226DR/AC（梅特勒托利多科技（中国））；实验室冰箱283（广州傲雪制冷设备有限公司）。

1.2 试验方法

1）制备中药液。取试验所需的9味中药每种80 g，分别加入1 000 mL超纯水浸泡1 h使其有效成分析出，随后加热煮沸再小火慢煮至80 mL，过滤取中药清液，将滤渣再加超纯水至800 mL，重复煎煮至80 mL，取中药清液。将两份清液样品混合后离心，取上清液继续煎煮至80 mL，再进行高温灭菌处理。将中药样品液放置恒温4 ℃的医用冰箱冷藏备用。

2）金黄色葡萄球菌悬液制备。将冷冻保存的标准菌株在营养琼脂上划线复活并使其处于37 ℃环境温度下培养24 h。培养完成后将金黄色葡萄球菌菌落接种到7.5%氯化钠肉汤中。将菌液接种到Baird-Parker培养基上，37 ℃至长出金黄色葡萄球菌菌落呈圆形，表面光滑，湿润，菌落直径为2～3 mm，细菌排列呈葡萄球状颜色呈深灰黑色，有浅色边缘。将菌液稀释至3.0×108 CFU/mL，留存备用。

3）抑菌试验。使用牛津杯法进行抑菌试验，通过在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈[5]。抑菌圈的判定为：抑菌圈直径大于20 mm为极度敏感（++++）；抑菌圈直径在20～15 mm之间为高度敏感（+++）；抑菌圈直径在15～10 mm之间为高度敏感（++）；抑菌圈直径小于10 mm为低度敏感（+）；无抑菌圈为不敏感（-）[6]。

4）测定最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）。在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度即为该菌悬液对该种指示菌的MIC。 MBC是指能够杀灭培养基内99.9%以上测试细菌菌量的最低浓度。本研究采用试管稀释法测定所测样品组的MIC及MBC。本研究所有测量性试验均重复三次。

5）测定双联中药复方抑菌浓度（FIC）。根据尹光美等[7]的研究方法，本研究使用棋盘稀释法进行联合抑菌定量法，计算部分抑菌浓度（FIC）指数：FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。

判别标准为：协调作用（FIC<0.5）；相加作用（0.5<FIC<1）；无关作用（1<FIC<2），拮抗作用（FIC>2）。

2 结果分析

2.1 9味中药对金黄色葡萄球菌的体外抑菌程度

试验数据结果如表1所示，可知9味中药对金黄色葡萄球菌产生了不同的抑菌效果。其中7味对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，而沙参和山药对金黄色葡萄球菌不产生抑菌效果。在7味有效抑菌的中药中，金银花、诃子的抑菌等级为极度敏感，蒲公英、甘草的抑菌等级为高度敏感，黄连次之抑菌等级为中度敏感，而艾叶白芷抑菌等级为低度敏感。

2.2 MIC和MBC的测定

试验数据结果如表2所示，诃子和金银花在抑金黄色葡萄球菌方面表现最佳，其中金银花和诃子的MIC为7.813 mg/mL，MBC为15.625 mg/ mL，蒲公英和甘草的MIC为15.625 mg/mL，MBC为31.250 mg/ mL；黄连、艾叶以及白芷在抑金黄色葡萄球菌方面表现不佳，其中黄连的MIC为125.000 mg/mL，MBC为250.000 mg/ mL；艾叶和白芷的MIC为250.000 mg/mL，MBC为500.000 mg/ mL。因此，根据以上试验结果对于抗金黄色葡萄球菌效果来说，诃子和金银花效果更好。

2.3 中药复方FIC指数测定

试验数据结果如表3所示，结果显示不同种类的双联中药复方的MIC和FIC不同。其中蒲公英+金银花、蒲公英+诃子、诃子+金银花的相关作用均为相加。而金银花+甘草、蒲公英+甘草、诃子+甘草的相关作用为无关。不过与单一中药相比双联中药复方的MIC值均有下降。且抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度呈负相关，即MIC愈小，抑菌圈愈大，抑菌效果越好。因此，选择合适的中药进行联合复方使用对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更好。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种强大的细菌，可导致人类和动物的严重疾病甚至死亡。此外，它是牛、奶牛、羊和山羊乳房炎的主要原因之一，其可以对奶牛的乳房组织造成不可逆的损伤，并且导致牛奶产量和质量大幅下降，给乳制品行业造成相当大的经济损失[8]。金黄色葡萄球菌外毒素在包括乳腺炎在内的感染中发挥作用，治疗主要依靠抗生素如青霉素，氨苄西林钠和苯唑西林钠。根据沈冬梅等[9]的试验结果表明，氨基糖苷类、氯霉素类药物对于金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，青霉素类、大环内酯类药物在治疗奶牛乳房炎方面应用得较多，我国优先选择抗生素类药物治疗奶牛乳房炎，但是长期使用抗菌药会使致病菌产生耐药性难以提高治疗效果，此外乳汁中的抗生素残留也难以攻克。这极大地影响了奶牛的乳汁质量并造成经济损失。

中药来源于植物、动物和矿物中提取的天然产物和提取物，具有维持健康和治疗疾病的有效生物功能。几十年来，它在全球范围内广泛使用[10]。早在东汉时期，中医典籍《神农本草经》就记载了中医在治病方面的应用。中药药理学研究表明，中药以及其提取物可以有效改变细胞中细胞膜的通透性从而改变细菌细胞壁的生理性质，从而可以通过改变蛋白质合成以及DNA复制转录过程来发挥药理作用[11]。

本试验共纳入金银花、诃子、蒲公英、甘草、黄连、艾叶、连翘、沙参、山药共9味中药，其中金银花、诃子、蒲公英、甘草、黄连、艾叶、连翘，均表现出了对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，并且金银花、诃子、蒲公英、甘草抑菌效果突出，表现出了极度敏感的抑菌效果，MIC 结果为7.813～15.625 mg/mL，MBC 结果为15.625～31.25 mg/mL。查阅文献可知金银花、诃子、蒲公英、甘草均为抗菌抗炎效果极好的中草药。其中金银花具有广谱的抗病毒、抗菌效果，能抑制多种病原微生物的生长。金银花的有效抗菌成分为绿原酸和异绿原酸为主，其可以改变致病菌细胞的细胞膜和细胞壁生理特性从而抑制细菌的代谢酶活性[12]。诃子含有的诃子鞣质可以对生物膜产生影响[13]。蒲公英抑菌作用与黄酮类、酚酸类、多糖有关，其抑菌机制为可以破坏细胞膜的完整性，从而致使金属离子、蛋白质和糖类物质渗出，导致细菌细胞代谢紊乱，最终导致细胞死亡，起到抑菌作用[14]。类似的甘草中也含有黄酮类化合物以及多糖，从而也可以通过影响细胞膜以及细胞壁的生物活性发挥抑菌的效果[15]。

因此，中药抗菌研究有很大发展空间以及前景。但也有些问题需要注意，首先中药作为中华文明五千年的结晶，其种类繁多，成分复杂，还有很多成分尚未探索透彻，因此在进行中药联合治疗时要特别注意不同的中药复方是否会产生毒性成分从而造成损失；其次，人们对中药及其中药复方生理层面以及分子层面的了解知之甚少，因此在后续的研究中可以更多地对中药分子层面发挥作用影响进行讨论；再次，不同的中药其有效成分不同，因此其有效成分的提取方式、提取温度、保存条件也不同，要注意不同中药的有效成分的提取工艺；最后，为了更高效地对中药进行研究，建议在选择中药时先查阅相关资料参考中药的药用价值，以做到优选更合适的中药作为试验对象。

4 结论

本研究试验结果显示中药可以有效地对造成奶牛乳房炎的致病菌金黄色葡萄球菌产生体外抑制作用。此外，通过试验结果可知适宜的中药组方联用的MIC数值更小，说明相比于单一的中药有更好的抑菌效果。

中药治疗奶牛乳房炎可以很好地改善致病菌耐药性以及乳汁中抗生素残留问题，并且一些中药可以作为饲料添加使用来预防疾病，因此更多地筛选出高效的中药来治疗奶牛乳房炎对我国的畜牧业蓬勃发展是有重大意义的。希望后续的研究中可以尽快地筛选出更多而有效的中药及中药联用来改善奶牛乳房炎高发、难治疗的现状。■

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