一株牙鲆源哈维氏弧菌的分离鉴定及抗性研究

摘要：自秦皇岛昌黎养殖的患病牙鲆 （Paralichthys olivaceus）体内分离获得一株革兰氏阴性菌，对其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列进行分析，鉴定其为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）；对分离菌株进行了30种抗菌药的药敏试验和11株益生菌的拮抗试验，得出此分离菌株对米诺环素、左氧氟沙星、头孢他啶、氟苯尼考、头孢曲松、诺氟沙星、环丙沙星、强力霉素、复方新诺明等13种药物高度敏感，对克林霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素、苯唑西林等9种药物表现为不同程度的耐药性；地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

关键词：牙鲆 （Paralichthys olivaceus）；哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）；分离鉴定；药敏试验；拮抗试验

牙鲆（Paralichthys olivaceus）俗称牙片、偏口、比目鱼、平目、左口等，是渤海湾的重要土著种，也是我国北方辽宁、河北、天津和山东等地的重要鱼类增养殖品种[1]。随着牙鲆养殖规模的不断扩大，各种病害也频繁发生，其中细菌性疾病最为常见。哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）隶属于弧菌属（Vibrio）[2]，在自然界中分布广泛，可广泛引起海水养殖鱼、虾、蟹等感染发病[3-9]。本研究从患病牙鲆的病灶处分离出了一株病原菌，通过测序、生理生化等手段进行了鉴定，对分离菌株进行了常规抗菌药的药敏试验，同时，利用河北农业大学海洋学院病害实验室分离保存的11株益生菌对分离病原菌进行了拮抗试验。本研究希望能够确定其敏感药物及具有拮抗作用的益生菌，旨在为牙鲆细菌性疾病的研究和防控提供参考。

1材料与方法

1.1患病牙鲆

患病牙鲆来自秦皇岛昌黎县某牙鲆养殖场，体质量260～470 g/尾。主要症状：患病牙鲆体色明显发黑；有眼侧部分鳞片脱落、出血；无眼侧鳍边发红；尾鳍鳍条间组织溃烂；鳃丝呈粉红色，部分鳃丝溃烂；解剖发现，病鱼肝脏有线性淤血，胆囊肿大，肠道无食物、充满水样液，中肾呈粉红色缺血状，脾脏淤血。

1.2病原菌的分离鉴定

1.2.1病原菌的分离及纯化取患病的牙鲆，解剖，分别挑取体表溃烂处、鳃丝溃烂处、肠道内容物、中肾等部位划线接种于2216E和TCBS固体培养基，28 ℃下培养18～24 h；挑选培养基中形态一致的单个优势菌落进行再次划线接种， 重复此操作，直至获得形态特征完全一致的菌落。记录菌落的形态特征。将分离纯化的菌落置于终浓度50%的甘油保护剂中， -80 ℃保存。

1.2.2分离菌的鉴定

1.2.2.1生理生化分析鉴定分离纯化的菌株暂命名为 VH0522，将隔夜培养的菌落接种于细菌微量生化鉴定管中， 28 ℃培养，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版）[10]和《常见细菌系统鉴定手册》[11]对VH0522各项生理生化指标的测定结果进行分析。

1.2.2.2分子生物学鉴定利用细菌总基因组DNA提取试剂盒提取菌株VH0522的DNA，进行16S rDNA扩增，采用通用引物（正向引物为27F： 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1 492 R： 5′-TACG GTTACCTTGTTACGAC-3′）， 扩增目的片段的序列全长为1 477 bp。将扩增产物送至上海迈浦生物科技有限公司测序。用DNA Sequencing analysis软件进行分析比对。使用MEGA11的Neighbor Joining方法构建系统进化树。

1.3药敏试验

在TCBS培养基上使用30种抗菌药对分离菌株VH0522进行药敏试验， 每种药物设3个平行。28 ℃ 培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径， 测量值取 3个平行的平均值。

1.4益生菌拮抗试验

在LB固体培养基上采用双层平板打孔法进行益生菌抗性试验。当上层平板经灭菌后降温至45 ℃左右时，加VH0522菌液0.1 mL （浓度为108 CFU/mL）。在加菌液后的上层平板上使用经灭菌的打孔器打孔，每个平板上打6个间隔相近的孔，打孔时不能穿过下层培养基，用经灭菌的牙签挑出孔中的上层培养基。每个孔内加菌液浓度为104～108 CFU/mL的20 μL益生菌液。每组设3个平行，1个空白对照。28 ℃培养 24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径，判断不同益生菌在不同菌液浓度下对VH0522的拮抗效果。试验地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热带芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌、产碱假单胞菌、极小短小杆菌、贝莱斯芽孢杆菌等11种益生菌，益生菌来自河北农业大学海洋学院病害实验室。

2结果与分析

2.1细菌形态学观察

对VH0522革兰氏染色后光学显微镜观察为革兰氏阴性杆菌。28 ℃培养 24 h后，2216E固体培养基上的菌落形态呈乳白色、圆形，表面光滑； TCBS固体培养基上的菌落形态呈黄色、圆形，表面较光滑。

2.2生理生化特性分析

生理生化结果显示，分离菌株VH0522在麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、赖氨酸脱羧酶、明胶、西蒙氏枸橼酸盐、甘露醇、氧化酶、鼠李糖、蕈糖、3％氯化钠碱性蛋白胨水等方面反应为阳性；在鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、乳糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、七叶苷、木糖、苦杏仁苷、丙二酸盐、蛋白胨水、水杨素、苯丙氨酸等方面反应为阴性，且不能产生硫化氢 （见表1）。参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版），发现分离菌株 VH0522 与哈维氏弧菌的生理生化特性基本一致。

2.3分子生物学鉴定

将分离菌株VH0522的16S rDNA序列与GenBank 中已公布的序列进行BLAST 比对分析，发现与哈维氏弧菌的同源相似性达到 9986%。构建的系统发育树见图 1，结果显示与哈维氏弧菌的亲缘关系最近。

综合菌株VH0522 的表型、生理生化特征及 16S rDNA 测序及系统发育树分析结果， 可以判定菌株 VH0522 为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）。

2.4药敏试验

药敏试验的具体结果见表2。结果显示：菌株VH0522对30种抗菌药物中的米诺环素、四环素、氯霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、亚胺培南、头孢他啶、氟苯尼考、头孢曲松、诺氟沙星、环丙沙星、强力霉素、复方新诺明等13种药物高度敏感，对红霉素、头孢呋辛钠、头孢哌酮、卡那霉素、链霉素、哌拉西林、庆大霉素、阿卡米星等8种药物敏感，对克林霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素、苯唑西林等其它9种药物表现为不敏感。

2.5益生菌拮抗试验

益生菌拮抗试验的具体结果见表3。结果显示：地衣芽孢杆菌在108 CFU/mL 浓度时表现出较好的拮抗效果，而107 CFU/mL浓度时拮抗效果则明显降低，而106 CFU/mL以下浓度时则完全没有拮抗作用；枯草芽孢杆菌的表现与地衣芽孢杆菌相似，在108 CFU/mL浓度时展现出一定拮抗作用， 107 CFU/mL浓度时拮抗效果降低，106 CFU/mL以下浓度时也完全失去拮抗作用。其他9种益生菌在所有浓度时对菌株VH0522都没有拮抗作用。

3讨论

哈维氏弧菌是海水养殖的常见致病菌，已有的报道显示曾导致多种海水养殖动物患病，从不同养殖动物、不同发病地区分离出的哈维氏弧菌表现出不同的药物敏感性。许悦等[6]对从海南养殖石斑鱼溃疡病上分离鉴定的哈维氏弧菌进行了药敏试验，结果显示对四环素类药物高度敏感；滕爽爽等[7]从浙江发病泥蚶（Tegillarca granosa）上分离鉴定的哈维氏弧菌也对四环素类药物高度敏感；郭美玲等[8]从天津养殖的青石斑（Epirzephelas awoara）分离鉴定的哈维氏弧菌同样对四环素类药物高度敏感；以上试验结果与本试验结果一致。但裴立硕等[5]从天津养殖的点带石斑鱼（Epinephelus coioides）上分离鉴定的哈维氏弧菌却对部分四环素类药物耐药（四环素、强力霉素），部分中度敏感（米诺环素）；孔明慧等[4]从豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）上分离鉴定的哈维氏弧菌对部分四环素类药物耐药（米诺环素），部分中度敏感（四环素）。孔明慧等[4]从豹纹鳃棘鲈上分离鉴定的哈维氏弧菌对氨基糖苷类药物中度敏感，裴立硕等[5]从天津养殖的点带石斑鱼上分离鉴定的哈维氏弧菌对氨基糖苷类药物也表现为中度敏感，这两个试验结果与本试验结果相同；而滕爽爽等[7]从浙江发病泥蚶上分离鉴定的哈维氏弧菌则对氨基糖苷类药物高度敏感；许悦等[6]从海南养殖石斑鱼溃疡病上分离鉴定的哈维氏弧菌对氨基糖苷类药物则表现为耐药。另外，上述所有药敏试验中，哈维氏弧菌对喹诺酮类药物均表现为高度敏感。以上结果显示同一种病原菌的不同菌株间可能在药物敏感性上存在一定差异，这可能与菌株的来源有关，不同地区、分离的不同年份、不同养殖品种或不同养殖模式的养殖业者的用药习惯或用药方式有很大区别，其结果是导致养殖动物体内或养殖环境中的不同菌株的耐药性出现明显区别。蒋魁等[9]、王春艳等[12]、吴越等[13]、胡大胜[14]、邓玉婷等[15]的研究也得出了相似的结论。

益生菌现如今已经愈来愈被水产养殖从业者所接受，在水产养殖中的应用也愈来愈广泛。益生菌目前主要被养殖业者应用到养殖水体中用来控制或改良水环境，如改良池塘底质，去除水中的氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等有害物质；另外，添加到饲料中用以改善养殖动物的肠道菌群结构、提高饲料利用率。除此外，理论上益生菌还可以在水环境和养殖动物肠道中拮抗致病菌，尤其是在水环境中使用消毒剂后，此时病原菌密度相对较低，益生菌可以快速占领生态位。本研究的结果显示，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对哈维氏弧菌有一定拮抗作用，但只在107 CFU/mL以上的高浓度时才有一定效果，而其他益生菌均没有拮抗作用。利用益生菌拮抗条件致病菌来防控病害是减少抗生素使用的有效路径，目前能够商品化使用的益生菌种类还相对较少，应加大筛选力度；此外，如何能够在微生态环境更为复杂的养殖生产中更有效地实现这一路径还需要进一步研究。

参考文献：

[1] 宫春光.牙鲆养殖技术及发展[J].科学养鱼，2002（2）：26-27.

[2] 郑天伦，王国良，金珊.海水养殖动物弧菌病防治的研究进展[J].台湾海峡，2002（3）：372-378.

[3] 朱贝贝，方皓，李煜，等.文蛤病原菌哈氏弧菌的分离鉴定与药敏试验[J].山东畜牧兽医，2017，38（9）：4-5.

[4] 孔明慧，黄丽芳，廖国威，等.豹纹鳃棘鲈哈维氏弧菌的分离鉴定与耐药分析[J].仲恺农业工程学院学报，2021，34（4）：16-20.

[5] 裴立硕，朱永龙，毛晴，等.点带石斑鱼致病性哈维氏弧菌的分离鉴定及药敏试验[J].天津农学院学报，2021，28（4）：35-40.

[6] 许悦，王印庚，周永灿，等. 海南地区养殖石斑鱼皮肤溃疡病病原的分离、鉴定、药敏分析及病理学研究[J]. 海南大学学报自然科学版，2018，36（2）：153-163.

[7] 滕爽爽，张炯明，张利兵，等. 泥蚶致病性哈维氏弧菌的分离与鉴定[J]. 水产科学，2022，41（4）：547-555.

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[9] 蒋魁，徐力文，苏友禄，等.两株珍珠龙趸病原性哈维弧菌（Vibrio harveyi）的分离与鉴定[J].生态科学，2017，36（6）：16-24.

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[11] 蔡妙英，东秀珠.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

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[13] 吴越，郑伊诺，陆荣茂，等.温州地区水产品中哈维氏弧菌的耐药分析[J].水产科学，2020（6）：39.

[14] 胡大胜.广西水产养殖主要细菌病的监测与耐药性调查[J]. 中国科技成果， 2010（13）： 49-51.

[15] 邓玉婷，谭爱萍，张瑞泉，等.广东主要水产养殖地区气单胞菌耐药状况的调查分析[J]. 南方农业学报， 2019， 50（11）： 2375-2383.

Isolation， identification and resistance of Vibrio harveyi isolated

from Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）

GAO Peiyu GUO Kaiying YIN Rui GONG Chunguang

（1. Zhangjiakou Aquatic Technology Extension Station，Zhangjiakou 075000， China;

2.Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao 066003，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences，Qinhuangdao 066201，China）

Abstract：A Gram-negative bacterium was isolated from diseased cultured Japanese flounder （Paralichthys olivaceus） in Changli， Qinhuangdao. Its morphological characteristics， physiological and biochemical properties， as well as its 16S rDNA sequence were analyzed， identifying it as Vibrio harveyi. The isolated strain underwent antibiotic susceptibility testing with 30 antibiotics and an antagonistic experiment with 11 probiotics. The results revealed that the isolated strain exhibited high sensitivity to 13 antibiotics， including minocycline， levofloxacin， cefotaxime， florfenicol， norfloxacin， ciprofloxacin， doxycycline and compound sulfadiazine among others; while showing varying degrees of resistance to 9 antibiotics such as clindamycin， penicillin and ampicillin. Two probiotics， Bacillus licheniformis and B. subtilis， demonstrated antagonistic effects on the strain at certain concentrations.

Key words：Paralichthys olivaceus; Vibrio harveyi; isolation and identification; antibiotic susceptibility testing；antagonistic assay

（收稿日期：2024-07-22；修回日期：2024-08-12）