LC-ICP-MS法同时测定富硒大米中有机硒和无机砷

摘要：采用液相色谱-电感耦合等离子体质谱（LC-ICP-MS）技术，建立富硒大米中有机硒和无机砷同时检测的方法，用于检测湖北省市售富硒大米中有机硒和无机砷的含量。富硒大米前处理方法选用15 mg蛋白酶E和15 mg蛋白酶K混合提取，色谱条件采用Aglient ZORBAX SB-Aq色谱柱，流动相为20 mmol/L柠檬酸溶液+5 mmol/L己烷磺酸钠溶液+1%甲醇溶液（pH=4.0），1 mL/min流速进样，质谱采用HEHe模式，可在5 min内完全分离出3种有机硒和2种无机砷。3种有机硒和2种无机砷在1～50 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.999 0，As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、MeSeCys、SeMet的检出限分别为0.10、0.12、0.18、0.15、0.15 μg/L，满足检测要求。无机砷的回收率为96.2%～101.3%，相对标准偏差为2.5%～3.9%，有机硒的回收率为72.4%～100.6%，相对标准偏差为2.1%～4.1%。该方法操作简便、快速、灵敏度高，可用于富硒大米中有机硒和无机砷的同时检测。

关键词：富硒大米；有机硒；无机砷；LC-ICP-MS法

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）09-0191-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.032 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous determination of organic selenium and inorganic arsenic in selenium rich rice by LC-ICP-MS method

SU Ying， LIN Jin， FENG Hao， LI Yue， GUO Qing-qing， ZHOU Tao-hong

（Key Laboratory of Detection Technology of Focus Chemical Hazards in Animal Derived Food for State Market Regulation/Hubei Engineering Technology Research Center for Food Quality and Safety Testing/Hubei Shizhen Laboratory， Hubei？Provincial？Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430075， China）

Abstract： Using liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry （LC-ICP-MS） technology，a method for simultaneous detection of organic selenium and inorganic arsenic in selenium-rich rice had been established， which was used to detect the content of organic selenium and inorganic arsenic in selenium-rich rice sold in Hubei Province. The pre-treatment method for selenium rich rice involved the mixed extraction by using of 15 mg proteinase E and 15 mg proteinase K，the chromatographic conditions were performed using an AgClient ZORBAX SB Aq column， and the mobile phase consistd of a 20 mmol/L citric acid solution， a 5 mmol/L sodium hexane sulfonate solution， and a 1% methanol solution （pH=4.0）. Sample in jection was conducted at a flow rate of 1 mL/min， mass spectrometry used HEHe mode， and three types of organic selenium and two types of inorganic arsenic were separated completely within 5 minutes. The three types of organic selenium and two types of inorganic arsenic showed a good linear relationship ranging from 1 to 50 μg/L， with correlation coefficients （R2） greater than 0.999 0；the detection limits of As （Ⅴ）， As （Ⅲ）， SeCys2， MeSeCys， and SeMet were 0.10， 0.12， 0.18， 0.15， and 0.15 μg/L， respectively， which met the detection requirements. The recovery rate of inorganic arsenic was 96.2%～101.3%， with a relative standard deviation of 2.5%～3.9%；the recovery rate of organic selenium was 72.4%～100.6%， with a relative standard deviation of 2.1%～4.1%. This method was easy to operate， fast， and highly sensitive， and could be used for simultaneous detection of organic selenium and inorganic arsenic in selenium rich rice.

Key words： selenium rich rice； organic selenium； inorganic arsenic； LC-ICP-MS method

硒（Se）元素存在于自然界中，土壤中的硒会被农作物吸收，人类则通过农作物吸收硒元素［1］。中国绝大部分土壤含硒量较少，大米是中国主要的食物，但是大米中硒含量较低，为了获得富硒大米，人们开始将大米种植在天然富硒土壤中或对土壤施加硒肥。硒是双功能元素，在一定范围内具有抗癌、解毒、抗衰老等作用，硒摄入量不足会引起缺硒性疾病，如克山病、大骨节病、心脏病等［2］，硒摄入量过大则会引起硒中毒［3］，因此对食品中硒元素的监测至关重要。

土壤中重金属对农作物的毒害主要表现为抑制植物生长、降低作物产量，甚至增加可食部位重金属含量，污染土壤中的重金属砷（As）较易向农作物子实迁移［4］，这将会直接危害人类健康。研究表明，适量Se可提高农作物抗As能力，并调控农作物对As的吸收累积，其主要机理为Se、As因具有相同的转运蛋白和吸收通道而竞争吸收，而且高Se处理能显著提高谷胱甘肽过氧化物酶活性、增加根中非蛋白巯基物质和络合素含量，从而缓解As的毒害［5，6］。砷可分为无机砷和有机砷，无机砷毒性强于有机砷，而土壤中砷的形态主要以三价砷［As（Ⅲ）］和五价砷［As（Ⅴ）］的形式存在。人类可能通过多元化的途径暴露于无机砷及其化合物，而近年来，食物成为无机砷暴露的重要来源，其对人体健康构成的潜在威胁已经成为研究者关注的焦点［7］。因此，控制大米中无机砷的含量使其符合GB/T 2762—2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的标准，同时关注富硒大米中有机硒的含量，对于富硒食品质量安全有着重要的意义，也是地方硒产业持续发展的基石。

硒和砷元素形态分析通常采用液相色谱-原子荧光光谱法（LC-AFS）、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（LC-ICP-MS）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS）、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）及其他联用技术。液相色谱-电感耦合等离子体质谱法具有分离效率高、灵敏度高等优点。姜伟等［8］采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定富硒大米中硒代胱氨酸、L-硒-甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸3种有机硒形态。Ma等［9］采用酶辅助萃取和离子对反相色谱- ICP-MS/MS联用技术测定水稻中Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸、L-硒-甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）和硒代蛋氨酸，水稻中的硒代蛋氨酸是主要的硒形态。Da rose等［10］建立了液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定米浆中As（Ⅲ）、二甲基亚砷酸（DMA）、甲基亚砷酸（MMA）和As（Ⅴ）的方法，其中米浆中As（Ⅴ）是主要的砷形态。

同时检测富硒大米中有机硒和无机砷的研究罕有报道，本研究采用液相色谱-电感耦合等离子体质谱法，对富硒大米中硒、砷提取条件和色谱分离条件进行优化，建立同时检测富硒大米中3种有机硒和2种无机砷的方法，以期为富硒大米中有机硒和无机砷的形态分布规律及含量监测提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

富硒大米为湖北省食品质量安全监督检验研究院抽检的市售大米；硝酸（优级纯）、甲醇（色谱纯）均购于赛默飞世尔科技公司；柠檬酸（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、四丁基溴化铵（分析纯）、Tris-HCl缓冲液、氨水（优级纯）、盐酸（优级纯）均购于国药集团化学试剂有限公司；蛋白酶E购于百灵威公司；蛋白酶XIV购于Sigma公司；蛋白酶K购于Merck公司；L-硒-甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）标准溶液、硒代蛋氨酸（SeMet）标准溶液、硒代胱氨酸（SeCys2）标准溶液、亚砷酸盐［As（Ⅲ）］标准溶液、砷酸盐［As（Ⅴ）］标准溶液均购于中国计量科学研究院；去离子水电阻率>18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器与设备

ME403型电子天平，美国METTLER TOLEDO公司；Multiwave 7000型超级微波消解仪：奥地利Anton paar公司；8800电感耦合等离子体质谱仪，美国Aglient公司；1260高效液相色谱仪，美国Aglient公司；827 pH lab pH计，瑞士Metrohm公司；5810离心机，德国Eppendorf公司；SB25-12DTS型超声波双频清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；WNE29型恒温振荡水浴锅，德国Memmert公司。所有玻璃仪器均用硝酸溶液（20%）浸泡24 h以上，用去离子水冲洗干净，烘干备用。

1.3 方法

1.3.1 仪器工作条件 采用调谐溶液对ICP-MS进行优化，液相色谱-电感耦合等离子体质谱法的工作参数如表1所示。

1.3.2 样品前处理

1）酸浸提法。准确称取粉碎过筛的富硒大米样品0.3 g于超级微波消解管中，加入3 mL硝酸溶液，200 ℃、30 min微波消解。待消解程序结束后置于赶酸板上赶酸20 min。取出消解管，冷却至室温后转移至离心管，用去离子水定容至25 mL，使用ICP-MS进行测定。每个样品做3次平行，并做空白试验［11］。

2）酶提取法。准确称取粉碎过筛的富硒大米样品1.0 g于离心管中，加入15 mg蛋白酶K、15 mg蛋白酶E和20 mL Tris-HCl提取液，于37 ℃恒温振荡箱中浸提过夜。提取后离心，取上清液过0.22 μm水性滤膜后待测，每个样品做3个平行，并做空白试验［12］。

1.4 数据处理

数据采用Excel 2019软件分析，Origin 2022软件作图。

2 结果与分析

2.1 色谱峰的定性与定量

硒有6种同位素，分别为74Se、76Se、77Se、78Se、80Se、82Se。其中，80Se的自然丰度最高，占比为49.61%，但是在质谱检测中，会使用氩气作为载气，但80Se会对检测结果造成干扰［13］。因此本研究选择78Se和75As的积分面积作为定量依据，将3种有机硒和2种无机砷的标准溶液单独进样，根据单标的保留时间确定本试验目标物质的出峰顺序。由图1可知，5种目标物质的出峰顺序为As（Ⅴ）、SeCys2、As（Ⅲ）、 MeSeCys、SeMet，并且在5 min内可将5种目标物质完全分离。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择 由于目标物质中存在有机硒和无机砷2类化合物，根据前人研究的结果［14-16］，选择5种流动相同时测定有机硒和无机砷（表2）。流动相1能将3种有机硒分离，无机砷中仅As（Ⅴ）出峰；流动相2可在5 min内将5种目标物质完全分离，且峰分离完好；流动相3可在5 min内将5种目标物质分离，但是各峰的分离度较小，不是最优选择；流动相4仅分离出2种有机硒，2种无机砷无法完全分离；流动相5与流动相3目标物质的出峰时间相似，2种无机砷的分离度较小，无法完全分离。综上，选择20 mmol/L柠檬酸+5 mmol/L己烷磺酸钠溶液+1%甲醇溶液作为后续试验的流动相。

2.2.2 流动相pH的选择 目标物质的分离效果会受到流动相pH的影响。本试验以20 mmol/L柠檬酸+5 mmol/L己烷磺酸钠溶液+1%甲醇溶液为流动相，选择不同的pH（3、4、5、6、7），探究有机硒和无机砷的分离效果。结果表明，当pH=3时，3种硒和2种砷出峰的时间为6 min，且SeMet拖尾严重。随着pH的升高，5种目标物质的保留时间逐渐减小，各峰的峰型得到改善，pH在4～6时5种目标物质均能实现基线分离。当pH=7时，As（Ⅴ）和As（Ⅲ）无法完全分离。综合分离度及工作效率，流动相的pH取4。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取条件的选择 当用0.1 mol/L的盐酸溶液协同超声波提取时，色谱图仅出现As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的色谱峰，未分离出3种有机硒；当提高盐酸溶液的浓度或者增加超声波的时间后，仍然无法提取分离出3种有机硒。酶水解法的色谱图出现As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2和SeMet的色谱峰，未见MeSeCys的峰。Zhao等［17］的研究表明，富硒大米中有机硒以SeMet为主，同时可能存在少量的SeCys2，与本研究的结果基本一致。因此本研究采用酶水解法进行试验。

2.3.2 提取条件的优化 提取有机硒、无机砷的酶主要有蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV、脂肪酶等［18］。Zhang等［12］使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶提取扇贝中的硒，Zhao等［17］使用40 mg蛋白酶、20 mg脂肪酶和5.0 mL水提取富硒大米中的硒。无机砷采用1%的硝酸溶液提取［19］。本研究选择Tris-HCl溶液（pH=7.5）作为缓冲液，蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV 3种蛋白酶作为提取剂，对富硒大米中无机砷和有机硒进行提取，单独使用时，酶的加入量为30 mg，2种酶混合使用时每种酶加入量为15 mg，3种酶混合使用时每种酶加入量为10 mg，结果如图2所示。当蛋白酶单独使用时，有机硒提取率为45.8%～63.4%，其中蛋白酶K的提取率最低，其次为蛋白酶XIV，蛋白酶E的提取率最高；无机砷提取率为69.5%～74.0%，其中蛋白酶XIV的提取率最低，其次为蛋白酶K，蛋白酶E的提取率最高。当蛋白酶混合使用时，有机硒、无机砷的提取率均明显上升。蛋白酶E和蛋白酶K混合使用时有机硒提取效果最好，提取率为89.9%；蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV混合使用时无机砷提取效果最好，提取率为96.2%。综上，本研究选择15 mg蛋白酶E和15 mg蛋白酶K的混合酶。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线与检出限 分别配制浓度为1、5、10、20、50 μg/L的As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、SeMet和MeSeCys混合标准溶液，按“1.3.1”的条件进行上机测定。以目标物质色谱峰的峰面积为纵坐标，硒、砷的浓度为横坐标进行线性回归分析，结果如表3所示。3种有机硒和2种无机砷在1～50 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.999 0，As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、MeSeCys、SeMet的检出限分别为0.10、0.12、0.18、0.15、0.15 μg/L，满足检测要求。

2.4.2 精密度与准确度考察 对富硒大米样品进行3个梯度水平的加标回收试验，3种有机硒和2种无机砷的回收率和相对标准偏差（RSD）如表4所示。无机砷的回收率为96.2%～101.3%，相对标准偏差为2.5%～3.9%，有机硒的回收率为72.4%～100.6%，相对标准偏差为2.1%～4.1%。

2.4.3 富硒大米样品的测定 选取20个富硒大米样品进行硒含量测定，选取硒含量排前10的富硒大米样品，按照液相色谱-电感耦合等离子体质谱法进行无机砷和有机硒的测定，结果如图3和表5所示。富硒大米样品中有机硒主要是以硒代蛋氨酸的形式存在，其余有机硒未检出，无机砷均有检出。富硒大米的有机硒含量为0.059～0.204 mg/kg，符合GB/T 22499—2008《富硒稻谷》标准。邵鹏威等［20］同样使用液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定恩施富硒地区大米的硒形态，富硒大米中硒的形态主要是硒代蛋氨酸，与本研究的结果一致。同时，富硒大米无机砷含量为0.049～0.146 mg/kg，所有样品的无机砷含量均符合GB/T 2762—2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的限量。

3 小结

本研究建立的液相色谱-电感耦合等离子体质谱法将富硒大米样品中的3种有机硒和2种无机砷进行有效分离。使用20 mL Tris-HCl缓冲溶液添加15 mg蛋白酶K和15 mg蛋白酶E对富硒大米进行前处理提取，并选择用20 mmol/L柠檬酸+5 mmol/L己烷磺酸钠溶液+1%甲醇溶液（pH=4）作为流动相，在5 min内将As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、SeMet和MeSeCys分离。采用该方法对湖北省市售的富硒大米进行检测，发现富硒大米的有机硒主要成分为硒代蛋氨酸，富硒大米样品的有机硒含量均符合国家标准，无机砷的含量也均低于国家标准的限量。本方法能够快速有效地对市售富硒大米中有机硒和无机砷含量进行检测，为后续更多食品中有机硒和无机砷含量检测提供参考。

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收稿日期：2023-10-13

基金项目：湖北省重点研发计划项目（2022BBA0077）；湖北省市场监督管理局科技计划专项（Hbscjg-KJ2023005）

作者简介：苏 莹（1997-），女，湖北荆门人，助理工程师，硕士，主要从事食品质量与安全研究，（电话）13774067369（电子信箱）513278616@qq.com；通信作者，林 津（1988-），女，湖北武汉人，高级工程师，硕士，主要从事食品质量与安全研究，（电子信箱）524153439@qq.com。

苏 莹，林 津，冯 灏，等. LC-ICP-MS法同时测定富硒大米中有机硒和无机砷［J］. 湖北农业科学，2024，63（9）：191-195．