民族药水河剑水提和醇提取物急性毒性试验及抗炎镇痛有效部位筛选

摘要：对水河剑（Diplazium lanceum）药材水提物及醇提物的急性毒性进行初步研究，并筛选水河剑药材具有抗炎镇痛效果的极性部位。使用最大给药量测定方法对小鼠灌胃给药，得到水河剑水提物及醇提物的最大耐受量（MTD），考察水河剑用药的安全性；采用小鼠醋酸扭体及热板法考察水河剑不同极性部位的镇痛效果；采用小鼠耳肿胀法考察水河剑药材不同极性部位的抗炎效果；用ELISA法，测乙酸乙酯提取物（高、中、低）对小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎症因子含量的影响。结果表明，水河剑水提物及醇提物急性毒性试验中均未能得到半数致死量（LD50），水河剑药材水提物和醇提取物最大耐受量分别为238.0、165.2 g/kg；水河剑药材不同极性部位提取物对小鼠的舔足时间都有所延长；水河剑药材不同极性部位均对小鼠扭体有抑制效果，各组镇痛率为11.14%～40.36%，其中镇痛效果最好的为乙酸乙酯部位，其次为石油醚部位；水河剑药材不同部位均对小鼠耳肿胀有抑制效果，各组耳肿胀抑制率为24.71%～48.47%，乙酸乙酯及石油醚部位抗炎效果最好；乙酸乙酯高、中、低剂量组小鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）炎症因子含量与模型对照组相比均有所下降，乙酸乙酯低、中剂量组的IL-1β、PGE2含量及乙酸乙酯低剂量组的TNF-α含量与模型对照组相比具有显著差异。

关键词：水河剑（Diplazium lanceum）； 最大耐受量； 急性毒性试验； 抗炎镇痛； 有效部位

中图分类号：R284.1；R284.2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）09-0119-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Acute toxicity test of water extract and alcohol extract of ethnic medicine Diplazium lanceum and screening of anti-inflammatory and analgesic effective parts

ZHOU Chu-hui， DENG Qing-mei， CHEN Yong， YANG Wen-ling， WEI Pei， QIN Xue-mei

（Guangxi Scientific Research Center of Traditional Chinese Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China）

Abstract： The acute toxicity of water and alcohol extracts of Diplazium lanceum was preliminarily studied and the polar sites with anti-inflammatory and analgesic effects were screened. The maximum tolerable dose （MTD） of the water and alcohol extracts of Diplazium lanceum was obtained by gavage administration to mice using the maximum dosage measurement method， and the safety of Diplazium lanceum was investigated； the analgesic effect of different polar parts of Diplazium lanceum was investigated using mouse acetic acid twisting and hot plate method； the anti-inflammatory effects of different polar parts were investigated using the mouse ear swelling method； the effect of ethyl acetate extract （high， medium， low） on the levels of inflammatory factors in the serum of mice with xylene- induced ear inflammation was measured using ELISA method. The results showed that LD50 was not obtained in the acute toxicity experiment of water extract and alcohol extract of Diplazium lanceum. The MTD of water extract and alcohol extract were 238.0 g/kg and 165.2 g/kg， respectively； the extracts of different polar parts of Diplazium lanceum prolonged the mice’s licking time of feet； the different polar parts of Diplazium lanceum had inhibitory effects on mouse torsion， with analgesic rates ranging from 11.14% to 40.36% in each group. Among them， the ethyl acetate part had the best analgesic effect， followed by the petroleum ether part； different parts of Diplazium lanceum had inhibitory effects on mouse ear swelling， with inhibition rates ranging from 24.71% to 48.47% in each group， and ethyl acetate and petroleum ether parts had the best anti-inflammatory effects； the levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and prostaglandin E2（PGE2） inflammatory factors in the serum of mice in the high， medium， and low dose groups of ethyl acetate decreased compared to the model control group. The levels of IL-1β and PGE2 in the low and medium dose groups of ethyl acetate， as well as the level of TNF-α in the low dose group of ethyl acetate， showed significant differences compared to the model control group.

Key words： Diplazium lanceum； maximum tolerance； acute toxicity test； anti-inflammatory and analgesic； effective parts

水河剑为蹄盖蕨科植物单叶双盖蕨［Diplazium lanceum （Thunb.） Presl.］的全草，又名小石剑、飞刀剑、金星草等［1］，其味甘、微苦，涩，性寒，具有凉血、止血、利尿通淋、清热解毒等功效，用于治疗尿路结石、热淋尿血、目赤肿痛、肺结核等症［2］，在广西壮族［3］、瑶族等地作为民间习用药材使用，也是广西玉林制药厂消石片的原料药材。对于该科植物的研究主要集中于猴腿蹄盖蕨、双生短肠蕨［4］、菜蕨等植物，对单叶蹄盖蕨的研究较少，因此对单叶蹄盖蕨的研究很有必要，蹄盖蕨科植物的主要成分有黄酮类、多酚类、有机酸类和甾体化合物［5］，这些成分往往具有一定的抗炎镇痛作用。黄酮类化合物具有抗炎镇痛的效果，咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸等多酚类化合物均具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性，中药中的这些生物活性成分均为近期中药研究的热点。鲜见对水河剑药材水提物、醇提物的急性毒性试验研究，也没有对水河剑抗炎镇痛有效部位进行筛选的报道。本研究对水河剑药材的水提物及醇提物进行急性毒性试验并得出最大耐受量，为临床用药提供参考。并对水河剑药材有效的抗炎镇痛部位进行筛选，为下一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 76电子天平（EL204型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；数显恒温水浴锅（HH-S2型），金坛市医疗仪器厂；旋转蒸发仪（RE-52AA 型），上海亚荣生化仪器厂；智能热板镇痛仪，成都泰盟软件有限公司；冷冻干燥机（TF-FD-1型），上海田风实业有限公司；离心机（TGL-16G型），上海安亭科学仪器厂。

1.1.2 药材与试剂 水河剑药材采于广西壮族自治区及贵州省各县镇，经广西中医药大学郭敏教授鉴定为蹄盖蕨科植物单叶双盖蕨；冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司，批号20160606；醋酸地塞米松片，辰欣药业股份有限公司，批号221040205；罗通定片，四川迪菲特药业有限公司，批号220302；试剂盒，江苏晶美生物科技有限公司，批号202210。

1.1.3 实验动物 清洁级昆明种（KM）小鼠，体重18～23 g，雌雄兼用，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于清洁级实验室，标准颗粒饲料喂养，自由饮水饮食，照明时间为12 h光亮，12 h黑暗，试验前进行适应性喂养4 d。

1.2 方法

1.2.1 水河剑药材不同提取部位的制备 将水河剑药材全草切割成拇指大小碎块，称取水河剑药材10 kg，加10倍质量的50%乙醇，回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇。真空干燥得水河剑药材醇提取物1 718 g，醇提物得膏率为17.18%，放置冰箱备用。取醇提取物浸膏 1 518 g，用温水溶解并依次用不同极性的溶剂进行萃取，得石油醚（60～90 ℃）部位提取物共154.39 g，得膏率为1.86%；得乙酸乙酯部位提取物95.71 g，得膏率为1.08%；得正丁醇部位提取物185.52 g，得膏率为2.10%；得水部位提取物574.34 g，得膏率为6.5%。均放置冰箱备用，使用时配制相应浓度的溶液。

1.2.2 水河剑水提物及醇提物急性毒性预试验 选取体重在21 g左右的KM清洁级小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养4 d，按照体重进行随机分组。首先随机选取16只KM小鼠，分别以水提与醇提可溶解的最大混悬浓度经口灌胃。水提组最大混悬浓度为13.28 g/mL（每毫升含有13.28 g生药量），醇提组最大混悬浓度为5.50 g/mL（每毫升含有5.50 g生药量），其他给药组每组设置6只KM小鼠，雌雄各半，以水提组及醇提组的最大混悬浓度为初始浓度进行等比级数设置（r1=1.306 6，r2=1.160 0），根据死亡情况设置组别，逐步探索零致死量（Dm）。上述各给药组按小鼠最大给药体积40 mL/kg进行灌胃，空白组以等体积的等离子水灌胃。给药前12 h禁食。给药4 h后正常喂养，连续观察14 d。如果预试验无法得出水河剑药材水提取物和醇提取物的半数致死量，则进行最大给药量试验。

1.2.3 最大给药量试验 选取体重在21 g左右的KM清洁级小鼠30只，雌雄各半，适应性喂养4 d，按照体重随机分为水提组、醇提组及空白组（去离子水）。水提组的灌胃生药浓度为5.95 g/mL，醇提组的灌胃生药浓度为4.13 g/mL，均以最大给药体积40 mL/kg进行灌胃，空白组使用相同灌胃方法以等体积等离子水进行灌胃。各组小鼠1 d灌胃给药1次，给药4 h后常规饲养，连续观察14 d。期间观察并记录小鼠饮食、活动、精神状态、皮毛肤色和大小便等，观察有无中毒症状及死亡现象出现。14 d时，处死全部小鼠，对小鼠眼球取血，测全血血常规，并解离出心、肝、脾、肺、肾，观察有无病变情况，并对其称重，计算其脏器系数（mg/g）。

脏器系数=脏器质量/体重 （1）

小鼠的最大给药量倍数=（每只小鼠最大给药量/小鼠平均体重）×（成人平均体重/成人每日用量）

（2）

1.2.4 水河剑药材镇痛活性部位的筛选

1）热板法。取用清洁级KM小鼠，雌性，体重18～23 g，进行热板试验，将小鼠置于热板仪上（55±0.5）℃，记录从小鼠足底接触热板至出现舔后足现象（潜伏期）作为小鼠痛阈，挑选痛阈为5～30 s的小鼠进行热板试验。将痛阈合格的170只KM小鼠随机分为模型对照组（吐温-80），阳性组（罗通定0.2 g/kg），水河剑石油醚部位高、中、低剂量组，水河剑乙酸乙酯部位高、中、低剂量组，水河剑正丁醇部位高、中、低剂量组，水河剑醇部位高、中、低剂量组，水河剑水部位高、中、低剂量组，共17个组，每组10只，其中低、中、高剂量组为成人（60 kg）每日剂量的2、4、6倍。灌胃（ig）给药，每天1次，连续7 d，末次灌胃给药后记录30、60、90、120 min的小鼠舔足潜伏期。并比较给药前后小鼠痛阈的变化，计算痛阈提高率［6，7］。

痛阈值提高率=［（给药后平均痛阈-给药前平均痛阈）/给药前平均痛阈值］×100% （3）

2）小鼠醋酸扭体试验。将170只清洁级KM小鼠，雌雄各半，按照“1.2.4”热板法进行随机分组，每组10只，灌胃（ig）给药，给药与喂养方法同“1.2.4”热板法。第7天灌胃给药1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，注射剂量为10 mL/kg，记录每只小鼠20 min内的扭体次数，并计算给药组小鼠镇痛抑制率［8-11］。

镇痛能力=［（对照组扭体次数-用药组扭体次数）/对照组扭体次数］×100% （4）

3）耳肿胀试验。将102只雄性清洁级KM小鼠按照“1.2.4”热板法进行随机分组，每组6只，灌胃（ig）给药，给药与喂养方法同“1.2.4”热板法，其中阳性组给抗炎药物醋酸地塞米松（0.000 6 g/kg）。第7天灌胃给药1 h后，左耳不做处理，右耳采用50 μL二甲苯均匀涂抹在耳朵两面致炎，致炎1 h后将小鼠脱颈处死，沿耳缘基线剪下左右两耳，采用 6 mm 打孔器对两耳同一部位打下圆耳片，于分析天平上称重，以同一小鼠两耳片之间的重量差异表示肿胀度，并计算肿胀抑制率比较抗炎效果［12-15］。

抑制率=［（对照组肿胀度-用药组肿胀度）/对照组肿胀度］×100%

4）乙酸乙酯提取物对小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎症因子含量的影响 将60只清洁级KM小鼠，雌雄各半，体重18～23 g，按照体重随机分组，每组12只共分为5组，为模型对照组（吐温-80），阳性组（罗通定0.2 g/kg），乙酸乙酯高、中、低剂量组。给药及喂养方式参考“1.2.4”热板法。第7天灌胃给药1 h后，左耳不做处理，右耳采用50 μL二甲苯均匀涂抹在耳朵两面致炎，致炎1 h后取小鼠眼球血，并用冷冻离心机以转速3 000 r/min在4 ℃条件下离心15 min，分离出血清。采用ELISA法用试剂盒与酶标仪检测血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）炎症因子的含量，按照试剂盒说明书进行操作［16-20］。

2 结果与分析

2.1 水河剑水提物及醇提物急性毒性预试验

由表1可知，水提组与醇提组小鼠灌胃给药后观察14 d，死亡率未能达80%以上，无法测得绝对致死量（LD100）及半数致死量（LD50），因此改测小鼠最大耐受量（MTD）来判断水河剑药材水提物及醇提物对小鼠的急性毒性作用。小鼠以最大混悬浓度灌胃4 h，个别小鼠出现四肢无力、活动减少、间歇性抽搐、呼吸急促、发抖等中毒症状，后续观察中毒症状可随时间延长逐渐缓解，也有小鼠染毒后24 h内死亡，解剖死亡小鼠，未发现内脏有质异性改变。可说明水河剑药材水提物及醇提物对小鼠有毒性。

2.2 最大耐受量试验

经毒性症状观察可知，进行试验的30只小鼠全部存活，绝大部分小鼠解剖所见：胸腔、腹腔未见异常液体，肠道未见胀气，心、肝、脾、肺、肾等主要器官形态质地正常、未见颜色改变及其他病理改变，胃黏膜颜色正常，无出血点。根据《广西中药材标准》记载水河剑药材成人每日服用生药量为9～15 g，故取15 g作为成人（60 kg）每日服用生药量。水河剑药材水提取物最大耐受量为238.0 g/ kg，醇提取物最大耐受量为165.2 g/kg（表2）。解剖两组小鼠，心、肝、脾、肺、肾的体重比值及体重增长与空白组小鼠相比均无显著差异（表3、表4）。两组小鼠血常规与空白小鼠相比，白细胞（WBC）数目、中性粒细胞（Neu）数目、淋巴细胞（Lym）数目、红细胞（RBC）数目、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、血小板数目（PLT）、血小板压积（PCT）都有所上升，其中水提组小鼠的WBC、Neu、RBC与空白组相比具有显著性差异，PLT、PCT与空白组相比具有极显著差异。醇提组小鼠的Neu、RBC与空白组相比具有显著差异，WBC、PLT、PCT与空白组相比具有极显著差异（表5）。

2.3 水河剑不同极性部位抗炎镇痛结果

2.3.1 水河剑不同极性部位对热板致痛阈值的影响 由表6可知，水河剑药材不同极性部位提取物组小鼠的舔足时间与模型对照组相比都有所延长，其中，水河剑药材的各部位提取物在给药后的30、60、90、120 min的其中1个或几个给药时间点，痛阈有显著提高（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。

2.3.2 水河剑不同极性部位对小鼠醋酸扭体的影响 由表7可以看出，水河剑药材不同部位均对小鼠醋酸扭体有抑制效果，与模型对照组相比，醇提高剂量组、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位均有显著抑制效果（P<0.05或P<0.01或P<0.001），各提取部位不同剂量组镇痛率范围为11.14%～40.36%。

2.3.3 水河剑不同极性部位对小鼠耳肿胀的影响 由表8可以看出，水河剑药材不同部位均对小鼠耳肿胀有抑制效果，与模型对照组相比，除醇提中剂量组外，水河剑药材水提部位，醇提低、高剂量组，石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位均有显著抑制效果（P<0.05或P<0.01），各提取部位不同剂量组耳肿胀抑制率为24.71%～48.47%。

2.3.4 乙酸乙酯提取物对小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎症因子含量的影响 由表9可以看出，与模型对照组相比，乙酸乙酯高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE2炎症因子含量均有所下降，其中乙酸乙酯低、中剂量组的IL-1β、PGE2含量及乙酸乙酯低剂量组的TNF-α含量具有显著下降（P<0.05或P<0.01），与阳性组相比，乙酸乙酯低剂量组的IL-1β、乙酸乙酯中剂量组的TNF-α、PGE2及乙酸乙酯高剂量组的TNF-α、IL-1β、PGE2均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。

3 小结

本研究测得小鼠一次性口服水河剑水提物及醇提物最大耐受量（生药量）分别为238.0、165.2 g/ kg，相当于成人（60 kg）日常用量的952.0倍和660.8倍，表明水河剑水提物及醇提物临床用量服用安全。血常规检测显示水提物与醇提物经口急性毒性可能导致小鼠炎症反应及凝血能力增强。通过小鼠热板法试验及小鼠醋酸扭体试验，发现水河剑药材不同极性部位均有一定镇痛效果，其中镇痛效果最好的为乙酸乙酯部位，其次为石油醚部位。通过小鼠耳肿胀试验，发现水河剑药材不同部位均对小鼠耳肿胀有一定的抑制效果，其中乙酸乙酯及石油醚部位抗炎效果最好。试剂盒结果显示，乙酸乙酯高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE2炎症因子含量与模型对照组相比均有所下降。本试验为水河剑药材的临床安全使用提供了参考，填补了水河剑抗炎镇痛药理作用的空白，但对水河剑药理药效研究仍不够深入，其抗炎镇痛机制还有待进一步研究。

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收稿日期：2023-09-18

基金项目：广西一流学科建设立项课题（2018xk060；2019xk105）；广西壮瑶药重点实验室开放课题（GXZYKF2022-11）；广西中药药效研究重点实验室研究课题（19-050-39-A6）；广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室项目（桂教科研［2014］6号）

作者简介：周楚惠（1998-），女，山东济宁人，在读硕士研究生，研究方向为中药质量分析，（电话）17860632091（电子信箱）545061701@qq.com；通信作者，陈 勇（1961-），男，江西南昌人，教授，主要从事中药民族药质量分析研究，（电子信箱）cy6381@163.com。

周楚惠，邓青梅，陈 勇，等. 民族药水河剑水提和醇提取物急性毒性试验及抗炎镇痛有效部位筛选［J］. 湖北农业科学，2024，63（9）：119-124．