球孢白僵菌利用D-PPA合成D-HPPA的发酵条件优化

摘要：为了提高球孢白僵菌（Beauveria bassiana）利用R-（+）-2-苯氧基丙酸（D-PPA）合成R-（+）-2-（4-羟基苯氧基）丙酸（D-HPPA）的能力，在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman设计和Box-Behnken中心组合设计优化球孢白僵菌生物合成D-HPPA的液态发酵条件。结果表明，当D-PPA初始添加浓度为40 g/L时，液态发酵最优条件为葡萄糖38.70 g/L、蚕蛹粉15 g/L、FeCl2 1.0 g/L、接种量15%（V/V）、pH 6.6及发酵温度28 ℃时，D-HPPA的产量为（25.10±0.43） g/L，D-HPPA的产率为57.24%±0.97%，比优化前提高了159%。

关键词：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）； 液态发酵； 条件优化； R-（+）-2-（4-羟基苯氧基）丙酸； Plackett-Burman设计； Box-Behnken中心组合设计

中图分类号：S482.4 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）09-0095-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.017 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of fermentation conditions for the synthesis of D-HPPA from D-PPA by Beauveria bassiana

PENG Ji-lan， YU Jie， LIU Zong-qiu， WANG Jin-hua， GAO Wa， WANG Yong-ze

（Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Ministry of Education & Hubei Province/Key Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education/Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： In order to improve the ability of Beauveria bassiana to synthesize R-（+）-2-（4-hydroxyphenoxy） propionic acid （D-HPPA） from R-（+）-2-phenoxy propionic acid （D-HPPA）， on the basis of single factor test， the liquid fermentation conditions of D-HPPA biosynthesis by Beauveria bassiana were optimized by Plackett-Burman design and Box-Behnken center combination design. The results showed that when the initial concentration of D-PPA was 40 g/L， the optimal conditions for liquid fermentation were glucose 38.70 g/L， chrysalis powder 15 g/L， FeCl2 1.0 g/L， inoculation amount 15% （V/V）， pH 6.6 and fermentation temperature 28 ℃. The yield of D-HPPA was （25.10±0.43） g/L， and the yield of D-HPPA was 57.24%±0.97%， which was 159% higher than that before optimization.

Key words： Beauveria bassiana； liquid fermentation； condition optimization； R-（+）-2-（4-hydroxyphenoxy） propionic acid； Plackett-Burman design； Box-Behnken center combination design

4-芳香基苯氧基丙酸类（APP类）除草剂具有价格低廉、除草效果好、毒性低和易降解等优点，被视为目前重要的除草剂［1，2］，而合成这种除草剂需要手性中间体—R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸（D-HPPA）。

D-HPPA的合成主要有化学合成法和生物合成法，化学合成法主要以D-乳酸甲酯和对苯二酚为原料，经氯代、缩合和酯化3步反应，最终得到D-HPPA［3］，尽管化学合成法的合成步骤较少，但其原料昂贵，合成条件苛刻，产率也较低［4］。相对于化学合成法，生物合成法具有产品纯度高、选择性强、合成效率高以及环境友好等诸多优点［5，6］，生物合成法通过利用生物体代谢途径中的酶或微生物菌株，可实现高效的D-HPPA生产，不仅能够提高产量，还能有效降低成本，此外，生物合成法还可以减少有毒副产物的生成，具有较好的环境友好性［7，8］。生物合成法主要通过球孢白僵菌（Beauveria bassiana）［8］、杂色曲霉［9］和草酸青霉［10］等微生物进行液态发酵合成D-HPPA，产量普遍较低，究其原因，主要是缺乏良好的发酵菌株，即使发酵效果较好的球孢白僵菌，发酵产量仍不理想。另一方面，由于D-HPPA液态发酵过程受多种因素的影响，培养基各组分间或者培养条件之间都存在复杂的交互作用，因此传统的单因素优化方法难以获得较好的发酵条件，从而限制了D-HPPA产量的提高。

在单因素优化的基础上，本研究运用Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken中心组合设计对球孢白僵菌液体发酵转化D-PPA为D-HPPA的条件进行优化［11，12］。这种策略不仅能找到影响液体发酵的主要因素，还能有效评估各发酵因素之间的交互作用，从而为D-HPPA高效生物合成打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 球孢白僵菌B3660，湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 试剂 R-（+）-2-苯氧基丙酸（D-PPA）和R-（+）-2-（4-羟基苯氧基）丙酸（D-HPPA）纯度均为98.0%，购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸钠、硫酸胺和硫脲等，购于国药集团化学试剂有限公司；蚕蛹粉，购于湖北工业大学南区菜市场。

1.1.3 仪器 ZHWY-2102C型恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；Centrifuge5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Waters e2695型高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC），美国Waters公司；DNP-9022型恒温培养箱，上海精宏分析仪器制造有限公司。

1.1.4 培养基

1）基础液体培养基（种子培养基）［8］：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，七水合硫酸镁2 g/L，二水合氯化钙1 g/L，磷酸氢二钾1.8 g/L，磷酸二氢钾0.75 g/L，微量元素溶液50 mL/L，pH 7.0。其中，微量元素溶液配方［8］：硫酸2 mmol/L，乙二胺四乙酸二钠2 000 mg/L，七水合硫酸亚铁600 mg/L，七水合硫酸锌200 mg/L，一水合硫酸锰150 mg/L，硼酸30 mg/L，六水合氯化钴20 mg/L，二水合氯化铜40 mg/L，二水合氯化镍40 mg/L，二水合钼酸钠5 mg/L。

初始发酵培养基［8］：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，七水合硫酸镁2 g/L，二水合氯化钙1 g/L，磷酸氢二钾1.8 g/L，磷酸二氢钾0.75 g/L，微量元素溶液50 mL/L，D-PPA 40 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 种子液的制备 将斜面保存的球孢白僵菌B3660接种于装有50 mL种子培养基的摇瓶中，将其放入28 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养2～3 d，用自制孢子过滤器过滤孢子，孢子经血球计数板计数，配制成浓度为1×107个/mL的孢子悬液。

1.2.2 单因素试验

1）培养基碳源种类及浓度优化。在初始发酵培养基中，分别用20 g/L的果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油代替葡萄糖，使用10%的孢子悬液作为接种量，在28 ℃、200 r/min条件下培养7 d，液相色谱检测D-HPPA的含量，选择D-HPPA含量最高的碳源作为最佳碳源，并优化其最佳碳源浓度（10、20、30、40、50、60 g/L）。

2）培养基氮源种类及浓度优化。在固定最优碳源及其浓度的条件下，将酵母粉替换为蛋白胨、牛肉膏、蚕蛹粉、尿素、硝酸钠、硫酸胺和硫脲，分别添加10 g/L到初始发酵培养基中，使用10%的孢子悬液作为接种量，在28 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养7 d，液相色谱检测D-HPPA的含量，选择D-HPPA含量最高的氮源作为最佳氮源，并对最佳氮源的浓度进行优化（5、10、15、20、25、30 g/L）。

3）培养基金属离子种类及浓度的优化［13］。固定最优的碳氮源及其浓度，在基础培养基中分别添加1.0 g/L的Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+和Na+，使用10%的孢子悬液作为接种量，在28 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养7 d，液相色谱检测D-HPPA的含量，选择D-HPPA含量最高的金属离子为最佳离子，并对其浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L）进行优化。

4）培养基接种量的优化。在上述优化的基础上，考察不同接种量对D-HPPA产率的影响，设置接种量为5%、10%、15%、20%和25%，置于28 ℃、200 r/min恒温摇床中培养7 d，液相色谱检测D-HPPA的含量并计算产率。

5）培养基初始pH的优化。在上述优化的基础上，考察不同pH对D-HPPA产率的影响，使用3.48 mol/L的HCl溶液调节初始培养基pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，使用15%的孢子悬液作为接种量，置于28 ℃、200 r/min恒温摇床中培养7 d，液相色谱检测D-HPPA的含量并计算产率。

6）培养温度的优化。考察不同培养温度对D-HPPA产率的影响， 温度调整为24、26、28、30、32 ℃，使用15%的孢子悬液作为接种量，pH为6.5，置于200 r/min恒温摇床中培养7 d后取样，检测D-HPPA的含量并计算产率。

1.2.3 Plackett-Burrnan设计 选取葡萄糖、蚕蛹粉、Fe2+、接种量、pH和温度6个因素进行试验设计，根据单因素优化结果，特别是产率最高的结果，确定各因素在设计中的低水平（-1）与高水平（+1），运用Minitab 21软件进行6因素2水平的Plackett-Burrnan设计，共12次试验，涉及因素及其水平见表1。

1.2.4 Box-Behnken中心组合设计 根据单因素试验和Plackett-Burman设计的试验结果，取葡萄糖（A）、接种量（B）和pH（C）3个因素作为自变量，以发酵7 d时D-HPPA的产率为响应值（Y）进行试验设计，Box-Behnken设计涉及的因素及其水平见表2。

1.2.5 HPLC检测条件 参考郝会会等［8］的检测方法检测HPLC。

1.2.6 D-HPPA产率计算

[D-HPPA产率=D-HPPA实际产量D-HPPA理论产量×100%]

1.2.7 数据统计分析 使用软件SPSS？26.0和Minitab？21进行数据处理和分析，采用Origin 2022软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同碳源种类及浓度对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 由图1可知，葡萄糖作为惟一碳源时，产率最高，为22.08%，而乳糖的产率最低，仅为6.60%，这表明球孢白僵菌更适合利用葡萄糖作为碳源［14］，因此选择葡萄糖作为后续试验的主要碳源，葡萄糖浓度优化结果见图2。

当葡萄糖浓度为40 g/L时，D-HPPA的产率达到最高，为26.03%；其次为50 g/L的葡萄糖，D-HPPA产率为24.22%（图2），综合考虑选择40 g/L的葡萄糖作为后续试验研究的最佳条件。

2.1.2 不同氮源种类及浓度对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 氮源是微生物生长和代谢所必需的重要营养物质，不同菌株对氮源的需求也有所不同。研究不同氮源对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响，试验结果如图3所示。

不同氮源对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响有显著差异，D-HPPA的产率大小为蚕蛹粉>硫脲>酵母粉>硝酸钠>蛋白胨>牛肉膏>尿素>硫酸铵。蚕蛹粉对D-HPPA的产率效果较好，产率为31.23%（图3），蚕蛹粉不仅可作为优质的氮源，且其对球孢白僵菌产酶具有一定的促进作用［15］。

进一步对蚕蛹粉浓度进行优化（图4），发现当质量浓度为15 g/L时，D-HPPA的产率达到最高，为32.44%。

2.1.3 不同金属离子种类及浓度对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 白僵菌的生长和相关酶的催化不仅需要碳氮源，还需要一定的无机盐［16］。考察了不同金属离子的添加对球孢白僵菌液态发酵合成D-HPPA的影响，结果见图5。

不同金属离子对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响不同（图5）。其中，添加Fe2+时，D-HPPA的产率最高，为33.62%。推测可能原因是，Fe2+是P450酶系循环所需要的离子［17］，能够促进球孢白僵菌生物合成D-HPPA。

根据图6的结果可以发现，添加1.0 g/L的Fe2+时，可以获得最高的D-HPPA产率，为34.53%。随着金属离子浓度的增加，D-HPPA产率开始降低，这可归结为高浓度的金属离子对细胞的生长和代谢产生了负面影响［18］。

2.1.4 不同接种量对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 接种量的大小影响白僵菌的生长，因此探究不同接种量对球孢白僵菌液态发酵的影响，结果如图7所示。

接种量为5%～15%时，D-HPPA的产率逐渐增加，达到最高点（35.22%），当接种量继续增加至20%和25%时，D-HPPA的产率开始逐渐降低。这可能是由于接种量较低时菌体生长缓慢，导致发酵周期延长；而接种量过高导致菌株提前老化，因此较低或较高的接种量都不利于D-HPPA的合成［19］。综合考虑，选择接种量为15%是后续试验研究的最佳选择。

2.1.5 不同pH对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 当初始pH在6.0～7.0时，D-HPPA的产率最高（图8）。通常来讲，更偏酸性的环境对真菌的生长有利，但这里还要考虑所催化酶最适的pH，推测白僵菌中的单加氧酶在pH为6.5左右时能达到最高酶活来促进催化。

2.1.6 不同温度对球孢白僵菌生物合成D-HPPA的影响 如图9所示，在28 ℃时，D-HPPA的产率最高，达40.97%。合成D-HPPA的温度与生长温度保持一致，表明细胞生长对催化起着积极的影响［20］。

2.2 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman设计的试验结果见表3。对表3数据进行方差分析，结果见表4。方差分析结果表明，对D-HPPA产率影响最显著的因素有X1（葡萄糖）、X4（接种量）和X5（pH），因此，选择这些因素进行下一步试验优化。

2.3 Box-Behnken中心组合试验设计及响应面分析

2.3.1 Box-Behnken中心组合试验设计及结果分析 根据表4 Plackett-Burman试验结果，选取葡萄糖（A）、接种量（B）和pH（C）为自变量，以D-HPPA产率（Y）为响应值，采用Minitab 21统计分析软件进行3因

使用Minitab 21软件对试验数据进行二次回归方程拟合，得到D-HPPA的产率对葡萄糖、接种量和pH的多元二次回归模型。

Y=-1 257.5+4.841A+1.50B+368.7C-0.054 39A2-0.091 8B2-27.62C2+0.028 9AB-0.163AC+0.022BC

（2）

由表6可知，模型极显著（P<0.01），失拟检测不显著（P=0.106>0.05），表明该模型在研究区域拟合较好，决定系数（R2）=0.983 5，且调整决定系数（R2adj）=0.953 7，表明该回归方程具有很好的拟合水平。在影响因素中，葡萄糖对D-HPPA的产率影响显著（P<0.05），pH对D-HPPA的产率影响极显著（P<0.01）。

用Minitab 21软件绘制葡萄糖、接种量和pH三者相互影响的响应面及等高线（图10）。葡萄糖和接种量的响应面坡度陡峭且等值线的形状为椭圆形，说明葡萄糖与接种量之间交互作用显著；葡萄糖与pH的曲面坡度相对于接种量与pH的陡峭程度要大，但交互作用均不显著，此结果与表6方差分析结果一致。

2.3.2 模型验证结果 从图10可以看出，该模型存在1个极大值，可通过对回归模型求最大值来得到优化后的响应值。软件求解结果表明，葡萄糖为38.69 g/L，接种量为15.05%，pH为6.56时，理论上D-HPPA的产率达到最大，为57.56%。为了方便实际操作，将最优发酵条件调整为葡萄糖38.70 g/L、接种量15%（V/V）和pH 6.6，然后进行了3次平行试验，D-HPPA的产率达57.24%，与预测值误差为0.6%，较优化前提升了159%，表明该模型能够较好地预测D-HPPA的实际产值。

3 小结

1）葡萄糖、接种量和pH是影响HPPA产率的重要因素，其中葡萄糖与接种量之间交互作用显著。

2）适宜的球孢白僵菌B3660的液态发酵产HPPA的条件为葡萄糖38.70 g/L、蚕蛹粉15 g/L、FeCl2 1.0 g/L、接种量15%（V/V）、pH 6.6及发酵温度28 ℃。在此优化条件下，D-HPPA的产率达57.24%，较优化前提升了159%，本研究的结果为提高D-HPPA产率打下了坚实基础。

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收稿日期：2023-04-17

基金项目：国家自然科学基金青年项目（31501677）；湖北工业大学博士启动基金项目（XJ2021010301）；企业合作项目（2020240）

作者简介：彭继兰（1997-），女，云南大理人，在读硕士研究生，研究方向为微生物有机酸发酵，（电话）15125293327（电子信箱）1205101606@qq.com；通信作者，王永泽（1976-），男，湖北潜江人，副教授，主要从事微生物代谢与发酵研究，（电话）15907137726（电子信箱）wangyongze@hbut.edu.cn。

彭继兰，余 杰，刘宗求，等. 球孢白僵菌利用D-PPA合成D-HPPA的发酵条件优化［J］. 湖北农业科学，2024，63（9）：95-101．