牛膝-续断药对抗骨质疏松作用及活性成分初探

【摘要】

目的：通过维甲酸建立骨质疏松小鼠模型，评价牛膝-续断药对的抗骨质疏松作用，探索其抗骨质疏松活性成分。方法：采用 HPLC法建立牛膝-续断药对提取物的指纹图谱；使用“中药色谱指纹图谱相似度指纹评价系统（2004 A版）”对不同组别进行相似度评价。维甲酸诱导小鼠骨质疏松模型，计算肝肾指数与股骨干湿比，应用酶标法检测不同提取物对维甲酸诱导骨质疏松模型小鼠血清ALP、ACP水平；应用Spss软件进行牛膝-续断提取物中各成分与模型小鼠股骨干湿比和血清中ALP和ACP酶含量的pearson相关性分析。结果：成功建立牛膝-续断药对提取物的HPLC指纹图谱，标定9个共有峰。肝肾指数结果显示模型组与给药组无显著差异，股骨干湿比结果显示大部分治疗组与模型组相比有显著性差异。ELISA结果显示，牛膝续断药对主要影响ACP水平。指纹峰与干湿比分析结果显示，峰1可能为活性成分；与ACP相关性分析结果表明峰1、2、3、7可能为活性成分。结论：牛膝-续断药对提取物对骨质疏松有治疗作用，其抗骨质疏松作用主要通过降低ACP水平实现，峰1可能为牛膝-续断抗骨质疏松活性成分。

【关键词】

骨质疏松；牛膝；续断

【中图分类号】R285.6

【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）16-0042-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.16.zgmzmjyyzz202416010

Preliminary Study on the Antiosteoporosis Effect and Active Ingredients of Achyranthes Bidentata-Dipsacus

GUAN DongxueNING ZhonghaiYUAN KaizhiLI XinyueSUN Yantao*

College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

Abstract：

Objective To establish an osteoporosis mouse model with retinoic acid， evaluate the anti-osteoporosis effect of Achyranthes bidentata and dipsacus， and explore its anti-osteoporosis active components. Method HPLC was used to establish the fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus. The similarity of different groups was evaluated using the “TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A）”. The serum ALP and ACP levels of different extracts of retinoic acid-induced osteoporosis mice were measured by enzyme-label method. The liver and kidney index and the dry-wet ratio of femur were calculated. spss software was used to analyze the pearson correlation between components of the extract and the dry-wet ratio of femur and the content of ALP and ACP enzymes in serum of model mice. Results HPLC fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus was established successfully， and 9 common peaks were identified. The results of liver and kidney index showed no significant difference between the model group and the administration group， and the results of dry and wet ratio of femur showed that most of the treatment groups had significant differences compared with the model group. ELISA results showed that achyranthes had a major effect on ACP levels. Fingerprint peak and dry-wet ratio analysis showed that peak 1 May be the active ingredient. The correlation analysis with ACP indicated that peak 1，2，3，7 might be the active components. Conclusion The extract of Achyranthes bidentata and dipsacus has therapeutic effect on osteoporosis， and its anti-osteoporosis effect is mainly achieved by reducing the level of ACP. Peak 1 may be the active ingredient of Achyranthes bidentata and dipsacus.

Keywords：

Osteoporosis; Achyranthes Bidentata; Dipsacus

中医理论认为“肾为先天之本”“肾生骨髓”“其充在骨”。骨的生长发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力；肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而萎弱无力。续断与牛膝两药均入肝肾两经，有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经之效。牛膝主降，引续断与牛膝药气下行；续断主升，与牛膝互补，调和药性。牛膝药性苦，具有坚阴作用，根据阴阳互根互用原则，对于肾阳的补充大有裨益；牛膝性苦，续断性辛，阴阳调和。两者在历来典籍中的结合颇多，效果上佳，是治疗骨质疏松的两样良药［1］。《魏氏家藏方》中使用牛膝、续断制成续断散，治疗老人风冷、转筋骨痛；坚骨方中取用牛膝10 g，川续断15 g，辅以熟地、当归等药材治疗老年骨质疏松，补肾益精，坚骨壮精；《证治准绳》中的续断丹，牛膝、续断与萆薢、杜仲同用，用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛。二者功效相辅相成，彼此增益，在骨质疏松的治疗上具有良效。

目前关于续断-牛膝药对的研究多为脊柱炎、关节炎等方面，鲜少有骨质疏松方面的报道［2］。李园园［3］通过数据挖掘得出胡荫奇教授对强直性脊柱炎常用用药组合含有续断、牛膝，为其处方核心组成成分。冯兴华治疗强直性脊柱炎的前5位药物为丹参、牛膝、赤芍、续断以及当归。赵宝宝等［4］发现单味中药及提取物与中药复方可以通过调控SCFAs 影响骨代谢，从而起到防治骨质疏松症的作用。马伟凤等［5］在实验中发现人参皂苷Rg3能够提高骨质疏松老年大鼠骨密度，改善骨微结构，作用机制可能是通过调节AMPK/mTOR信号通路促进自噬发挥骨保护作用。可见牛膝-续断具有良好的抗骨质疏松作用。为确定牛膝-续断抗骨质疏松作用，并筛选其中活性成分，本研究采用HPLC确定10批不同来源牛膝-续断药对的指纹共有峰，采用维甲酸诱导骨质疏松模型，分析给药组的股骨干湿比，肝、肾指数，ALP（小鼠碱性磷酸酶）和ACP（小鼠酸性磷酸酶）等免疫指标，通过色谱峰面积与药效指标相关性分析，探讨药对的抗骨质疏松活性成分。

1仪器与材料

1.1仪器岛津高效液相色谱仪（配置二元梯度泵，在线脱气机，SPD-10AVP紫外检测器）；Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；25 μL微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）；循环水式抽滤机（配有抽滤瓶，布氏漏斗，郑州长城科工贸有限公司）；万分之一天平（瑞士METTLER）；微量移液器（上海荣泰生化工程电热恒温有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2试药甲醇、乙腈（天津市凯信化学工业有限公司，天津市，色谱纯）；维甲酸（北京贝丽莱斯生物化学有限公司，纯度>96%）ALP，ACP（上海酶联生物科技有限公司，批号：m1002235）。阿仑膦酸钠（云南万裕药业有限公司，批号：1704004）

牛膝、续断经药学院鉴定教研室鉴定分别为苋科植物牛膝Achyranthes bidentateB1的干燥根和川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.exHenry的干燥根，随机分为10组。具体来源见表1。

1.3实验动物SPF级KM小鼠，体重（20±5） g，试验单位使用许可证编号：SYXK（辽）2013-0009， 实验动物伦理许可证号：SCXK（辽）2015-0001，均为雄鼠。

2方法与结果

2.1牛膝续断提取物指纹图谱测定

2.1.1供试品溶液制备取牛膝，续断粉末各11 g，精密称定，回流6 h，过滤后将提取液浓缩至35 mL，精密吸取5 mL，挥干溶剂，加甲醇定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，收集续滤液，备用。剩余30 mL溶液作为给药组溶液，备用。取阿仑膦酸钠肠溶片，精密称定，加蒸馏水，配置为0.3 g/mL的溶液。取维甲酸，精密G7KGwmSOCJdXehfb83Tw4Q==称定，加蒸馏水，配置为0.02 g/mL的溶液。

2.1.2色谱条件及系统适应性条件Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；流动相：乙腈为A相，水为B相，总流速1.0 mL·min-1；检测波长：250 nm；进样量：10 μL，梯度洗脱时间程序见表2。

2.1.3方法学考察分别安排精密度、重复性、稳定性实验，其结果均符合指纹图谱测定要求。

2.1.4样品测定按照“2.1.2”项下的色谱条件进样测定，并记录各批次样品色谱数据。将10批牛膝-续断药对提物HPLC图谱数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系（2004A版）”，设定参照图谱，将谱峰自动匹配，生成叠加图谱如图1，见表3。

2.2牛膝续断药对抗骨质疏松作用研究

2.2.1小鼠骨质疏松模型复制及分组给药KM小鼠，随机分为13组，每组10只。分别为空白对照组、模型组、阳性药（阿仑膦酸钠肠溶片）组和实验组。使用维甲酸构建骨质疏松模型，灌胃量0.2 mL/只，空白对照组灌等量安慰剂（生理盐水），为期14 d。造模同时，对实验组小鼠灌入牛膝续断提取物，灌胃量0.2 mL/只；阳性药组灌入等量阿仑膦酸钠肠溶片溶液；对照空白组灌等量安慰剂（生理盐水）。为期14 d。

2.2.2实验结果末次给药12 h后，对本实验13组小鼠称量体重后采血，称取肝，肾及右后股骨湿重。将股骨烘干后称取干重，进行计算得肝、肾指数（肝、肾指数即为肝、肾重量与小鼠体重之比）和骨干湿比（股骨干湿比即为股骨干重与湿重之比），按ELISA试剂盒操作流程测定小鼠血清样本中ALP及ACP的含量，结果见表4。结果表明，肝、肾指数无显著差异。与空白组相比，模型组股骨干湿比明显降低。与模型组相比，阳性组及大部分治疗组股骨干湿比明显升高。小鼠血清样本中ALP的含量无显著变化。与空白组相比，模型组ACP含量显著升高，与模型组相比，阳性组及各治疗组ACP含量显著下降。

2.3牛膝续断药对各成分与药效关系双变量相关分析可以描述两变量间线性关系的密切程度、相关性大小及方向。相关系数的大小反映两变量相关性的大小，正负表明方向。采用SPSS 19.0中双变量相关分析方法， 计算各样品共有峰的相对峰面积与ACP，ALP及骨干湿比的相关系数，详情见表5。结果表明，组分给药后体内色谱峰与药效相关性较大。

3讨论

骨质疏松是老年患者常见的疾病，随着我国老龄化趋势的不断上涨，骨质疏松的发病率也逐年增加［6-7］。因此，如何预防以及治疗此类疾病成为现代研究的首要问题。有文献报道牛膝［8］和续断［9］具有治疗骨质疏松的功效，本研究基于维甲酸建立骨质疏松小鼠模型，探究了牛膝-续断配伍药对的抗骨质疏松作用。

碱性磷酸酶（ALP）作为骨代谢和骨形成的标志物，其指标可评价骨转换与成骨细胞QuTtvUNsbJpS+vOwXidNig==分化程度，主要存在于成骨细胞胞浆中，与成骨细胞的成熟及分化呈正相关，是调节骨形成的重要物质。酸性磷酸酶（ACP）由破骨细胞分泌，存在于重吸收小囊泡中。ACP作为反映骨吸收的指标，对骨吸收有促进作用，具有潜在调节破骨细胞与骨结合的功能。可见ALP值愈高，ACP值愈小，越能体现出对骨质疏松的治疗效果。牛膝-续断药对治疗骨质疏松模型小鼠股骨干湿比结果显示，模型组与空白组有显著性差异，说明本实验模型建立成功。结果表明，各组提取物对股骨干湿比和ACP均具有显著的影响。由此得出，牛膝-续断药对具有良好抗骨质疏松作用，可能通过降低破骨作用来治疗骨质疏松。

通过建立指纹图谱，体现了牛膝续断药对的成分，提高了活性成分筛选的准确性。通过分析药对中相关化学成分与股骨干湿比，ACP相关性的结果可知，药对提取物中相关化学成分与股骨干湿比和ACP呈现良好相关性。特别是峰1与股骨干湿比呈良好相关性，且其与ACP呈明显负相关，说明其含量越高，ACP结果越小，抗骨质疏松作用越好，值得对其进行进一步深入研究。药对提取物对骨质疏松有治疗作用，对肝肾影响较小，其直接作用于骨，对骨吸收影响较大，可明显降低ACP水平，从而达到治疗小鼠骨质疏松的作用。

参考文献

［1］邓昶，周明旺，付志斌，等.骨质疏松症的中医病因病机及其治疗进展［J］.中国骨质疏松杂志，2017，23（8）：1105-1111.

［2］黎立. 当代中医骨伤科流派研究［D］.济南：山东中医药大学，2010.

［3］李圆圆. 基于中医传承辅助系统分析胡荫奇教授治疗强直性脊柱炎用药规律［D］.北京：北京中医药大学，2015.

［4］赵宝宝，李兴勇，董万涛，等.中药通过调控短链脂肪酸防治骨质疏松症的研究进展［J］.中国骨质疏松杂志，2023，29（1）：104-108.

［5］马伟凤，王亮，马彦巧，等. 人参皂苷Rg3通过调节AMPK/mTOR信号通路提高骨质疏松老年大鼠骨密度及骨代谢［J］.广州中医药大学学报，2023，40（1）：163-169.

［6］朱洁云，高敏，宋秋韵，等.中国老年人骨质疏松症患病率的Meta分析［J］.中国全科医学，2022，25（3）：346-353.

［7］李曾，常晓，王英杰，等.骨质疏松性骨折手术患者住院费用统计分析［J］.中华骨与关节外科杂志，2019，12（10）：786-790.

［8］于大永，吕晓超，史丽颖，等.牛膝中三萜皂苷抑制破骨细胞分化作用的研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2011，19（3）：9-10，13.

［9］牛银波，潘亚磊，李晨睿，等.续断防治骨质疏松的研究进展［J］.中国药理学通报，2013，29（7）：892-894.

（收稿日期：2024-11-20编辑：陶希睿）