6株多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

摘要：畜禽是多杀性巴氏杆菌的带菌者，当外界环境因素发生剧变，机体抵抗力低下时，该菌即侵入体内，发生内源性传染。也可由被污染的饮水，饲料、用具和外界环境经消化道传染，或由咳嗽、喷嚏排出的病原菌经呼吸道传染，以及经损伤的皮肤黏膜而传染。该病发生后，同种畜禽间能互相传染，不同的畜禽种间亦可交叉感染。多杀性巴氏杆菌病分布广泛，世界各地均有发生。目前，在我国多种家畜、家禽和野生动物中均有多杀性巴氏杆菌病发生，给畜禽生产带来很大的经济损失。

关键词：巴氏杆菌；分离；试验

1 材料与方法

1.1 病料来源

2011年9月6日，扬州地区送来1只1.5～2 kg重的麻鸭，饲养主共饲养了200只。根据病史及流行病学调查，该鸭群刚刚购回7 d。临床检查及病理剖检可见肝表面有浆液，黄色胶冻样渗出物覆盖，肠道黏连，腔内有大量纤维素性黏连，心肌出血并有坏死。

2011年9月13日，泰州姜堰送来3只70日龄的鹅，饲养主共饲养1 600只，其中死亡10只。根据病史及流行病学调查，该鹅群于13日龄时注射新支二联苗，未用药物治疗，病程约20 d，突然死亡。临床检查及病理剖检可见心肌有许多出血点，肝脏表面有大量白色坏死点，胰脏有出血，十二指肠出血严重，其他肠段也有出血，喉头支气管环状出血，脾脏肿大，部分肠段有出血性溃疡，气囊出血浑浊，肝脏、腺胃、肌胃均有出血。

2011年10月29日，泰州地区送来1只90日龄的邵鸭，饲养主共饲养5 200只，其中死亡3～5只。根据病史及流行病学调查，该鸭群中的病鸭，病程长，呈零星死亡。临床检查及病理剖检可见心肌严重出血，肠道严重出血并出现出血性溃疡，肝脏密布白色坏死点，胰脏充血，肺部出血，腺胃出血。

2011年10月30日，送来2只3月龄的麻鸭，饲养主共饲养50只。根据病史及流行病学调查，该鸭群有鸭突然死亡，约每天1只。临床检查及病理剖检可见心肌严重出血，浆膜出血，肝脏肿大，密布白色坏死点，肠道弥漫性坏死出血。

2012年1月9日，扬州地区送来4只70日龄的麻鸭，饲养主共饲养2 800只，其中死亡200只。根据病史及流行病学调查，近10 d来相继突然发病死亡，已用氟苯尼考、磺胺嘧啶等，未见显效，40 d前曾注射禽流感苗。临床检查及病理剖检可见心外膜、心肌点状出血，肝脏肿大，密布白色坏死点，小肠弥漫性出血。

2012年2月8日，扬州地区送来3只180日龄的鸭，饲养主共饲养1 900只，其中死亡3只。根据病史及流行病学调查，病情反复发生。临床检查及病理剖检可见肝密布白色坏死点，心肌出血，肠道内环状坏死并出血，气囊出血。

1.2 试验材料

培养基：普通营养琼脂，血琼脂培养基。购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司，扬州大学动物医院实验室自制。

染色液：革兰氏染色液、美蓝染色液。

生化发酵罐：鸟氨酸、阿拉伯糖、硫化氢、葡萄糖、果糖、乳糖、硝酸盐、卫矛醇、甘露醇、尿素、氨对、麦芽糖、甘露糖、木糖、赖氨酸、棉籽糖，共16种生化管。均购自杭州微生物试剂有限公司。

药敏试纸片：菌必治（30 μg/片）、诺氟沙星（10 μg/片）、美洛西林（30μg/片）、萘啶酸（30 μg/片）、复方新诺明（23.75/1.25 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、痢特灵（300 μg/片）、罗美沙星（10 μg/片）、多黏霉素B（300 U/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片）、多西环素（30 μg/片）、链霉素（10 μg/片）等，一共15种。购自杭州天和微生物试剂有限公司。

阳性血清：超级新生牛血清（Newborn Calf

Serum），购自杭州赛乐生物科技有限公司。

试验动物：ICR小鼠12只，来自扬州大学兽医学院比较医学中心。

其他器材：接种环、超净操作台、生理盐水、一次性灭菌注射器、生物显微镜、酒精灯、恒温培养箱、酒精棉球等。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离培养

将患病动物解剖检查，采集动物的肝脏、脾脏等内脏器官作为病料。在超净操作台中将镊子用酒精灯烧烫灭菌，然后用该镊子烫于病料表面，将病料表面的细菌杀死。然后用灭菌的剪刀在已经被灭菌的部位剪一道小口子，接着将在火上烤过的接种环伸入剪开的部位采集细菌，使用分区划线的方法接种于血清琼脂培养基。分别采集6个区域的病料，接种于血清琼脂培养基培养，分别标记为0906、0913、1029、1030、0109、0208，放于37℃恒温培养箱内，培养24 h，然后观察[1]。

1.3.2 染色镜检

分离。将已经培养出有细菌生长的培养基从温箱取出，并取一块干净的载玻片于实验操作超净台上。用注射器抽取生理盐水，并滴1滴于载玻片中央。然后用已经在酒精灯上烧红灭菌的接种环从培养基上挑取少量细菌，涂抹在载玻片中央的生理盐水中，使接种环上的菌落在生理盐水中分布均匀，涂成一均匀的薄层。

干燥固定。涂片最好在室温下使其自然干燥或将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发。

染色。在涂片薄膜上滴加1～2滴结晶紫染色液初染，约1～2 min，冲洗；然后使用1～2滴碘液进行媒染，约1～2 min，冲洗；用95%的乙醇进行脱色，约1 min，冲洗；最后用1～2滴复红染色液进行复染，约1～2 min，冲洗，干燥。

在显微镜下用1 000倍油镜镜检。

1.3.3 生化试验

先准备生化管6组，每组生化管包括鸟氨酸、阿拉伯糖、硫化氢、葡萄糖、果糖、乳糖、硝酸盐、卫矛醇、甘露醇、尿素、氨对、麦芽糖、甘露糖、木糖、赖氨酸、棉籽糖，共16种。将其打开，并将开头端在火上烤过以便消毒。用一次性灭菌注射器于每根生化管中滴加2～3滴犊牛血清，然后用接种环将六组细菌分别接种入每一组生化管中，每根生化管口用小团棉球堵口，防止其他细菌进入生化管，于37℃恒温培养箱中培养48 h后，观察结果。

判定标准参照该生化管生产厂家给出的标准。

1.3.4 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法，首先用棉棒蘸取传代血清琼脂平板上的菌落涂布整个血清培养基表面，反复几次，保证涂均匀。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。在菌接种后15 min内贴完纸片。将平板翻转，放入37℃恒温培养箱，孵育18～24 h后取出，用尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，这些都不作为抑菌环的边缘。药敏纸片有菌必治、氟罗沙星、美洛西林、萘啶酸、复方新诺明、卡那霉素、丁胺卡那霉素、痢特灵、罗美沙星、多黏霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、强力多西环素、链霉素，一共15种。

操作方法和判定标准参照该公司操作方法与标准。

1.3.5 致病性试验

将分离得到的多杀性巴氏杆菌菌株分别用生理盐水稀释。将每一株细菌分别以0.3 mL/只和0.1 mL/只腹腔注射于2只小鼠，总共接种12只小鼠。

观察小鼠12 h后的状况，并将其解剖，观察它们的病理变化。

2 结果

2.1 涂片镜检结果

分离菌株在血琼脂上生成灰白色，湿润而黏稠的菌落，不溶血。分离菌涂片经革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的球杆菌，单个或成对，偶尔呈链状或丝状。

2.2 生化试验结果

经微量生化发酵管试验结果（表1）可以看出这甘露糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、尿素、硝酸盐还原和鸟氨酸这9种生化管反应为阳性，棉籽糖、乳糖、木糖、卫矛醇、硫化氢、赖氨酸和氨基酸对照这7种生化管反应为阴性。因此这6株多杀性巴氏杆菌的菌株都基本符合巴氏杆菌的特征，包括显微特点和生化特点等。

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果（表2）显示，多杀性巴氏杆菌对丁胺卡那霉素为高度敏感；菌必治、美洛西林、卡那霉素、痢特灵、多年霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素等药物为中度敏感，而对罗美沙星和多西环素为低度敏感，对氟罗沙星、萘啶酸、复方新诺明和链霉素耐药。

2.4 动物试验结果

动物试验结果见图1。6组小鼠在接种后均表现出精神沉郁、食欲废绝的症状。接种细菌的小鼠在12 h内先后死亡，剖检所见病理变化为呼吸道有出血点，消化道黏膜也有出血点，肝脏充血并且肿大，其表面和实质内都散布有针尖大小的灰白色或灰色的坏死点。解剖小鼠后，取病变脏器进行细菌分离培养，并染色镜检，培养出来的细菌菌株的基本特征与所采集的6株多杀性巴氏杆菌菌株一致。在镜下可见革兰氏阴性球杆菌，美蓝染色呈两极浓染的小杆菌，血液培养基上培养24 h，见有表面光滑、边缘整齐的露珠状小菌落，不溶血，与先前分离出来的6株多杀性巴氏杆菌的菌株一致。

3 讨论

此次收集的病例均有胃肠道出血的特征，符合水禽类很多疾病的急性死亡的特点，无法只根据临床剖检，观察病理变化就做出诊断。所以，进行了病料的采集和细菌的分离培养，并且进行了这些菌株的染色镜检，生化试验，从而根据菌株的微生物特点和生化特性，结合了临床解剖，流行病学调查和病理症状，证实了这些病例均为多杀性巴氏杆菌感染，从而诊断这些禽病为巴氏杆菌病。

药敏试验结果表明，多杀性巴氏杆菌对丁胺卡那霉素为高度敏感，故可用此药对该病进行治疗；菌必治、美洛西林、卡那霉素、痢特灵、多年霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素等药物为中度敏感，而对罗美沙星和多西环素为低度敏感，对氟罗沙星、萘啶酸、复方新诺明和链霉素耐药，治疗效果不明显。

给动物接种的多杀性巴氏杆菌，导致小鼠在12 h内相继死亡，并且发现小鼠肝脏出血、坏死，呼吸道和消化道都有出现出血点，而且可以在死亡的小鼠体内分离得到多杀性巴氏杆菌，说明多杀性巴氏杆菌具有较强的致病性，可以导致动物的急性死亡。因此可以判定，该病对动物具有一定的危害性，在动物与动物之间具有较强的传染性，会给畜禽生产带来很大的经济损失。

目前，常用于防控禽类多杀性巴氏杆菌的疫苗主要有弱毒苗、灭活苗和亚单位疫苗等，对降低禽霍乱造成的损失有一定的作用，但因为多杀性巴氏杆菌的血清型较多、交叉免疫力差、保护期短，导致疫苗的免疫效果不理想，使该病在禽类群体中仍然时有发生。也有很多禽类的养殖场未经过巴氏杆菌疫苗的免疫，这也是该病发生的原因之一。近年来，禽霍乱出现了一些新的现象，如禽类多杀性巴氏杆菌与其他病原的混合感染现象较为普遍、抗生素滥用致使细菌的耐药性越来越强，症状的非典型化等，给该病的防控带来了新的难度。因此，当禽类的养殖场出现细菌性疾病时，应该及时进行细菌分离和药敏试验，筛选高敏药物，进行针对性的治疗，才能取得良好治疗和防控效果。

参考文献

[1] 杨宝凤，邹灵秀，李能章，等.6株牛源多杀性巴氏杆菌A型的分离鉴定及其部分生物学特性比较分析[C]//国家肉牛/牦牛产业技术体系疾病控制研究室.第四届全国牛病防治及产业发展大会论文集.西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室，2012.