玉米秸秆水解液发酵产L-苹果酸研究

L-苹果酸作为一种重要的有机酸，在食品、医药、化妆品和农业等领域都有着广泛的应用和重要的作用。本研究以玉米秸秆水解液为原料，对L-苹果酸产生菌米曲霉进行了定向驯化，筛选出一株具有较高水解液毒性耐受能力及较高L-苹果酸生产强度的驯化菌株C-28，对该菌株的培养基进行了筛选优化，优化后L-苹果酸产量达到84.7g/L，在5L发酵罐进行分批发酵放大试验，发酵84hL-苹果酸产量达到85.89g/L。

L-苹果酸是一种重要的有机酸，化学式为C4H6O6，在食品工业中被广泛应用，常用作食品酸味剂、抗氧化剂和酸度调节剂，还被广泛用于医药、化妆品、农业等领域。

玉米秸秆是一种来自农业废弃物的可再生资源，对其进行有效利用可以减少农业废弃物对环境的污染，实现资源的循环利用，同时可以减少对传统粮食作物的需求，缓解粮食危机。通过将玉米秸秆水解进一步转化为L-苹果酸，不仅可以生产有机酸产品，还可以利用其中的化学能作为生物能源，起到替代化石能源的作用，减少对可再生能源的依赖。米曲霉自身能够表达水解生物质的酶，实现木质纤维素等廉价生物质资源的高值化转化。本研究采用菌种定向驯化的方式，对L-苹果酸生产菌株米曲霉进行驯化选育，筛选耐高浓度玉米秸秆水解液的菌株，并通过发酵条件的优化提高菌株发酵L-苹果酸的产量。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

米曲霉（Aspergillus oryzae）A001，由新拓洋生物工程有限公司保存。玉米秸秆水解液，玉米秸秆经酸解预处理、干燥、酶解、补料、抽滤、浓缩等过程，制备成高浓度玉米秸秆水解液。经测定，其中含有葡萄糖：90.1g/L，木糖14.27g/L，纤维二糖4.42 g/L，阿拉伯糖0.89g/L，总还原糖109.7g/L。

1.1.2 培养基

产孢培养基：去皮鲜土豆200g煮沸约30min，过滤，在清液中加入20g葡萄糖、3g K2HPO4、1.5g MgSO4·7H2O、20g琼脂粉定容至1L，自然pH。

秸秆水解液-产孢培养基：产孢培养基中葡萄糖更换为：玉米秸秆水解液220mL。

种液培养基：30g/L葡萄糖，6g/L胰蛋白胨，0.56g/L KH2PO4，0.56g/L K2HPO4，0.75g/L NaH2PO4·2H2O，0.75g/L Na2HPO4。

驯化培养基：6g/L胰蛋白胨，0.56g/L KH2PO4，0.56g/L K2HPO4，0.75g/L NaH2PO4·2H2O，0.75g/L Na2HPO4，玉米秸秆水解液30%-100%。

基础发酵培养基：110g/L葡萄糖，12g/L胰蛋白胨，0.15g/L KH2PO4，0.196g/L K2HPO4·3H2O，70g/L CaCO3。

玉米秸秆水解液发酵培养基：12g/L胰蛋白胨，0.15mg/L KH2PO4，0.196g/L K2HPO4·3H2O，70g/L CaCO3。玉米秸秆水解液40%-100%。

以上培养基的灭菌条件：115℃，20min，其中葡萄糖/玉米秸秆水解液单独灭菌后与其余组分混合。

1.1.3 试剂

L-苹果酸、木糖标准样品：Sigma公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器与设备

全温振荡培养箱（ZQZY-88C，上海知楚仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（LS-75HD，江阴滨江医疗设备有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent1260，SantaClara，CA，USA）；SBA-40E生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）；5L发酵罐（上海楚怡生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法

生孢培养：从融化的冷冻管中吸取适量孢子液，接种于产孢培养基，34℃，培养4-6天。

种子培养：培养成熟的斜面中加入适量无菌水洗下孢子，过滤后制成一定浓度的孢子悬液。将孢子悬液接种于装液量为30mL的250mL三角瓶中，使孢子终浓度为1.5×106个/mL，37℃，200rpm，培养14h。

摇瓶发酵培养：吸取5mL种液于250mL发酵摇瓶中，装液量40mL，30℃，200rpm培养6天。

1.2.2 驯化筛选方法

将制备好的孢子悬液接种于驯化培养基中，摇床培养14h，之后每12h采用液液转接的方式传代一次，每转接3次，取新鲜菌液接种秸秆水解液-产孢培养基平板，挑选生长快的菌落，制备孢子悬液，按以上步骤循环持续驯化，当驯化培养基中生物量达到种液培养基中生物量水平时提高驯化培养基中水解液含量。

经过若干代驯化后，将菌液涂布秸秆水解液-产孢培养基平板，挑选出若干生长优良的单菌落，分别接种于斜面培养基，待斜面孢子成熟后，进行种子培养，种子长好后接种玉米秸秆水解液发酵培养基进行摇瓶发酵培养，从中筛选产酸较高的菌株。

1.2.3 分析方法

葡萄糖的测定：样品14000rpm离心5min，上清液稀释后生物传感分析仪进行检测。有机酸含量的测定：待测发酵液加入等体积2NHCl以溶解未消耗完的CaCO3和沉淀的有机酸，离心去菌体，滤液稀释数倍后经0.22um水系膜过滤后待测。采用高效液相色谱法，有机酸检测柱，流动相为5mM稀硫酸，柱温60℃，流速0.6mL/min，紫外检测器，波长为210nm。生物量测定：取适量发酵液加入等体积2NHCl，用滤纸过滤，再用去离子水洗涤菌体3遍，抽滤后65℃烘干至恒重，称重法测定生物量。

1.2.4 数据处理

各实验设置三个平行，试验数据采用Microsoft Excel 2019数据处理系统进行整理及分析。

2.结果与分析

2.1 玉米秸秆水解液发酵菌株的筛选

在玉米秸秆水解液中，除葡萄糖外，还含有木糖、阿拉伯糖，以及乙酸、糠醛、酚类物质等发酵抑制物。如果毒性超过菌种的耐受能力，其生长与生理代谢将会受到影响，最终使得目标产物发酵受抑制而无法进行。经过30代的驯化，筛选出31株菌株进行玉米秸秆水解液摇瓶发酵培养，结果见表1。

从表1可以看出，L-苹果酸产量较高的菌株有C-28、C-22、C-19，分别为67.3g/L、66.69g/L、66.02g/L，均高于出发菌株的32.01g/L。其中，C-28的糖酸转化率最高，为81%，是出发菌株的1.62倍，因此选定C-28为玉米秸秆水解液发酵出发菌株。

2.2 培养基氮源的优化

采用单因素试验考察不同氮源对100%玉米秸秆水解液发酵L-苹果酸产量的影响。按照含氮量进行折算，以大豆蛋白胨、豆粕粉、黄豆粉、玉米浆、酵母浸粉、尿素、硫酸铵等量替换培养基中的胰蛋白胨，分别配制培养基进行摇瓶发酵试验，结果见表2。

由表2可知，以豆粕粉为氮源时，L-苹果酸产量最高，其次是胰蛋白胨和大豆蛋白胨，而其它几种氮源黄豆粉、酵母浸粉、硫酸铵和尿素产量较低，特别是硫酸铵和尿素明显不利于L-苹果酸的合成，因此确定氮源为豆粕粉。

2.3 CaCO3质量浓度对产酸的影响

碳酸钙在米曲霉发酵L-苹果酸的过程中起着重要的作用，包括调节pH值、提供碳源、增加稳定性和改善产品质量等方面，有助于提高L-苹果酸的产量和质量。在发酵培养基中分别加入60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L的CaCO3进行摇瓶发酵实验，结果见表3。

由表3可知，CaCO3质量浓度为80g/L时L-苹果酸的产量最高为84.7g/L，随着CaCO3质量浓度的增加，L-苹果酸产量没有增加，且对葡萄糖得率呈下降趋势，因此确定CaCO3质量浓度为80g/L。

2.4 5L发酵罐分批发酵放大试验

经过摇瓶发酵条件优化，进一步在5L发酵罐上进行分批发酵放大实验，结果如图1所示。

由图1可知，在米曲霉发酵12h后，L-苹果酸开始大量产生，48-60hL-苹果酸生成速率达到最大，84h葡萄糖消耗完，L-苹果酸的产量达到最高值85.89g/L，此时L-苹果酸生成速率为1.02g／（L·h）。

结论

通过对L-苹果酸产生菌米曲霉的定向驯化，筛选出一株具有较高水解液毒性耐受能力及较高苹果酸生产强度的驯化菌株C-28，对该菌株的培养基进行优化后L-苹果酸产量达到84.7g/L，在5L发酵罐进行分批发酵放大试验，L-苹果酸产量达到85.89g/L。利用玉米秸秆水解液作为发酵原料生产L-苹果酸不仅有利于资源利用和能源生产，还可以缓解粮食危机，同时符合环境友好的生产理念，具有重要的经济和环境效益。

作者简介

杨林（1982.10-），男，汉族，河北保定人，本科，工程师；研究方向：发酵工程。

*通讯作者

张建国（1972.11-），男，汉族，河南驻马店人，本科，高级工程师；研究方向：生物化工。