一种农杆菌介导的在烟草叶片中实现外源基因瞬时表达的方法

摘要：烟草是一种被广泛使用的模式植物，经常被用于分子生物学研究。本研究利用农杆菌介导的转化技术研究了一种新的外源基因在烟草叶片中瞬时表达的系统。首先，通过PCR扩增目的基因，与质粒进行连接后与大肠杆菌转化培养，通过PCR、酶切验证和测序确认基因插入，再转化农杆菌。经侵染后成功在烟草中实现了目的基因（GFP）的表达。本研究有助于推进利用烟草作为模式植物的分子生物学研究，并在各个领域都有应用潜力。

关键词：烟草；农杆菌介导转化；瞬时基因表达；分子生物学研究

植物基因转化技术中，尽管存在转化效率低等问题，农杆菌介导的转化方法仍因其高效且便捷被广泛应用于基因功能研究。农杆菌注射技术作为新兴手段，以其瞬时表达和操作简便性，为高通量基因功能分析提供了可能。近年研究通过农杆菌介导的方法在植物中实现了外源基因的快速表达，为深入探索植物生物学提供了新的思路。这项技术已经广泛应用于基因表达、基因相互作用、蛋白表达以及疫苗生产等领域的研究。如唐伶俐等利用农杆菌介导成功建立了厚皮甜瓜遗传转化体系[1]。孙蔓莉等通过在本氏烟草上共表达RB和Avrblb1，探究了影响农杆菌介导基因瞬时表达效率的因素，如农杆菌菌悬液OD600值、菌系、植物品种及生长发育阶段等[2]。张悦婧等则以本氏烟草为材料，分析了不同农杆菌菌株、菌液浓度和侵染时间对瞬时转化过程中报告基因GFP荧光表达量的影响[3]。蔡澜峰通过基因质粒pCAMBIA2301为载体，在模式作物烟草上测试了五种农杆菌菌株侵染能力，以及5个甘蔗品种的遗传转化方法进行了一系列优化，包括愈伤组织、心叶和悬浮细胞三种靶组织类型[4]。这些研究展示了农杆菌注射技术快速、灵活和高效的特点，为植物基因功能研究提供了新的思路和手段，为深入探索植物生物学提供了重要的技术支持。本研究基于此，构建了一个农杆菌介导的烟草叶片外源基因瞬时表达体系，并进行了一系列验证，以期为植物基因表达提供新途径。

1 方法与材料

1.1 质粒提取与浓度测定

1.1.1 实验材料

大肠杆菌菌液（DH5α）：含有质粒的大肠杆菌菌株。

质粒提取试剂盒（TRAN Code：EM101-02 Lot：R51030-V2）；离心机（eppendorf Centrifuge 5424）；恒温金属浴（GINGOh2O³-100C）；吸附柱；Nanodrop。

1.1.2 实验方法

取1.5 mL大肠杆菌菌液，在10000G下离心1 min，弃去上清液，留下菌体。加入250μL预冷的Resuspension Buffer（RB），轻柔颠倒混匀。随后加入250μL Lysis Buffer（LB）8aznQdkbxag/64A9RgBALQ==，轻柔颠倒混匀6～8次。加入350μL Neutralizing Buffer（NB），轻柔颠倒混匀约10次后在12 000 G常温离心5 min，上清液移到吸附柱上，用12 000 G常温离心上清液1 min，倒掉清液。加入650μL Wash Buffer（WB）后12 000 G常温离心1 min，倒出液体再12 000 G常温离心1 min。加入30μL预热至65℃的Elution Buffer（EB），将质粒从橡胶柱上洗下，静置溶解1min，再10 000 G常温离心1 min。最终，用2μL样品进行分光光度计浓度检测。

1.2 引物设计和目的基因的PCR扩增

1.2.1 试验材料

上游引物pCB-GFP-F：5'- GGACTCTAGAGGAT

CCATGGTGAGCAAG -3'（BamHI酶切位点）。

下游引物pCB-GFP-R：5'- GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAG -3'（SacI酶切位点）。

质粒模板：载体质粒pCAMBIA1300-35S-空-

GFP。pCAMBIA1300-35S-空-GFP质粒含有GFP基因编码区。

Taq Mix酶；PCR仪（BIO-RAD T100™ Thermal

Cycler2）

1.2.2 试验方法

以含有GFP基因的pCAMBIA1300-35S-空-GFP质粒为模板进行GFP基因编码区的PCR扩增。PCR反应体系为50μL，其中，上下游引物（10μmol/L）各2μL，载体质粒pFF19 DNA 1μL（XX ng），Taq Mix酶 25μL，加水补至50μL。

扩展条件：

预变性：95℃，5 min。

变性：95℃，30 s。

退火：55℃，30秒。

延伸：72℃，1 min。

循环次数：34个循环。

最终延伸：72℃，50 min。

1.3 琼脂糖凝胶电泳

1.3.1 试验材料

琼脂粉（tsingke TSJ001）；1×TAE缓冲液；核酸胶染剂；PCR扩增产物；DNA Marker（tsingke DL2000 DNA Marker）；GoldenView染色剂；DNA loading（EDTA，溴酚蓝）。

1.3.2 试验方法

取0.4 g琼脂糖，加入40 mL1×TAE缓冲液中。随后，将混合物加热至溶解，然后冷却至65℃左右，加入4μL核酸胶染剂，充分混合。接着将胶板放入胶槽内并插入梳子，倒入琼脂糖凝胶溶液，等待其完全凝固后拔出梳子。将胶板放入电泳槽内，槽内加入足够的1×TAE缓冲液使其覆盖胶面。使用移液枪将样品加入胶孔内。随后将电泳槽连接至电源并设定180V恒定电压，直至溶液前端达到胶板底部。最后关闭电源，取出胶板，并进行照胶操作，以记录和分析凝胶上的DNA迁移带。

1.4 载体线性化与纯化

1.4.1 试验材料

大肠杆菌质粒（DH5a）；DNA loading buffer

缓冲液；BamHI-HF酶（NEW ENGLAND BioLabs

R3136S）；SacI酶（NEW ENGLAND BioLabs

R0156L）。

1.4.2 试验方法

线性化。在质粒载体线性化的试验中，加入37μL蒸馏水、6μL大肠杆菌质粒（1μg）、5μL缓冲液、1μL Bam-HI酶和 1μL SacI-HF酶。反应程序：37℃，1～2 h。

纯化。如前所述进行核酸电泳后，将胶板取出，将目的条带所在胶块切下称重，按照试剂所示流程进行胶回收，得到酶切产物。

1.5 线性化载体与目标片段的连接与菌落培养

1.5.1 试验材料

CE buffer（Vazyme 7E771E3）；EXuasell酶（Vazyme 7E771E3）；感受态大肠杆菌；LB培养基。

1.5.2 试验方法

首先在离心管中加入0.42μL DNA 片段（按照最适插入片段使用量=[0.04x 插入片段碱基对数]ng（0.06pmol）配比）与 6.5μL 载体（最适克隆载体使用量=[0.2×克隆载体碱基对数]ng（0.03pmol）配比），再加入CE buffer 4μL，EXuasell酶2μL，与去离子水7.06μL。其次将上述体系用PCR仪37℃培育30 min。之后将同源重组产物使用感受态大肠杆菌转化，37℃摇匀培养30 min后涂布在对应抗性的固体培养基上，倒置37℃过夜。

1.6 基因重组后的菌落的PCR鉴定

1.6.1 试验材料

Taq酶mix。

F端引物pCB-GFP-F：5’- GGACTCTAGAG

GATCCATGGTGAGCAAG -3’（BamHI酶切位点）。

R端引物NOS-R：5’- GATAATCATCGCA

AGACCGG -3’（在NOS终止子上）。

1.6.2 试验方法

挑取单菌落至40μL无菌水中。每个板挑取3个阳性菌落，取4份剂量的F端引物、R端引物、去离子水和Taq酶混合在一起，即F端引物和R端引物各4μL，40μL Taq酶，混匀。

配制PCR反应体系，进行核酸电泳，观察目的条带。

1.7 重组质粒提取与重组质粒的酶切验证

首先取37μL的蒸馏水放入离心管，其次加入1μg

质粒（按提取的浓度应加入4μL），接着加入5μL cutsmart缓冲液，构建cutsmart体系，再加入1μL BamHI，然后加入1μL XmaI，接着37℃金属浴1 h，如上所述进行核酸电泳。

1.8 农杆菌的重组DNA的导入

1.8.1 试验材料

农杆菌（GV301）；去离子水；含有GFP的质粒；感受态细胞。

1.8.2 试验方法

用提前培育2 d的农杆菌（GV301）取2μL质粒，与20μL感受态，在冰上静置5 min，然后放入液氮5 min，再37℃金属浴5 min，再在冰上静置5 min。28℃摇床2 h。接着把摇好的菌5 000 r/min离心1 min，吸去上清液，将剩余部分吹打混匀，滴加到培养基上，涂匀，在28℃培养2 d。

1.9 农杆菌侵染烟草

1.9.1 实验材料

农杆菌（GV301）；去离子水MgCl2溶液（1 mol/L）；

ASG-乙酰丁香酮（1 mol/L）；MES-2-吗啉乙硫磺（15 mol/L）。

1.9.2 试验方法

取提前培养好的农杆菌5 mL，5000rpm离心5 min。配置侵染液，1 mL MgCl2溶液（1mol/L）、1 mL ASG-乙酰丁香酮（1mol/L）、1 mL MES-2-吗啉乙硫磺（15 mol/L）。接着将离心好的菌液上清液倒出，取100μL，与900μL侵染液混合，在光度仪中测出浓度，运用公式（测出浓度×体积/需求浓度-体积）算出所稀释的量（2.15×5/1～5 mL）=5.75 mL。按这个浓度来配置所需溶液，将其放在摇床上培育2 h。然后将摇好的菌拿出，用针管吸取，将烟草叶子翻转，背面朝上，用针尖扎一个孔，然后取下针尖，用食指抵住背面用注射器头堵住叶片背面的孔，慢慢将注射器中的菌液到叶片里直至整个叶片都被菌液充满（若一个孔不能使这个叶片布满，则多扎几个），最后继续种植烟草约2 d。

2 试验结果与分析

质粒提取及浓度测定结果显示，组别1的质粒

浓度为247.956 g/μL，A260/A280为1.93左右，符合试验要求。这说明提取的质粒样品具有足够的浓度和较少的杂质。

以pCAMBIA1300-35S-空-GFP质粒为模板，使用pCB-GFP-F和pCB-GFP-R引物进行PCR扩增试验，通过琼脂糖凝胶电泳检测观察到明显的、符合预期大小的PCR条带（图1），成功得到了预期大小为750 bp的扩增产物，说明PCR成功。

图2的琼脂糖电泳图展示了载体线性化实验的结果。通过琼脂糖电泳图可以发现1号泳道的上方较亮的条带为10 000 bp左右的线性化后的载体，在下方较暗的条带为750 bp的线性化载体；2号泳道仅有一条较亮条带，长度约为750 bp，和BamHI位点与SacI位点之间的片段长度相符，应为目的基因的PCR产物，说明载体线性化与PCR有效。

菌落扩培结果显示，经过37℃、12 h的培养，培养基上含有GFP片段的菌落生长良好，有较多菌落，说明转化较为成功。

菌落PCR结果如图3所示，1、2、3泳道分别为培育好的含有GFP段落的不同独立菌落的样品，4为加入了无菌水的对照组。发现1、2、3泳道的条带大小、位置基本一致，说明其取样菌落均为真阳性，而4泳道的空白对照没有条带，说明无菌水无污染且实验有效。

（M为DNA marker DL2000，1、2、3为不同的独立菌落样本，4为加了无菌水的对照重组质粒提取与重组质粒的酶切验证实验结果如图4所示，可以看到泳道1、2均有一条较亮、长度约在10 000 bp的条带，但由于酶切位点BamHI与XbaI之间还未插入目标基因序列，只有极少量bp的片段，切下来的片段过短，在琼脂糖凝胶电泳图上不可见。所以图中没有第二条较小条带为正常情况，实验有效。

M为DNA marker DL2000，泳道1、2为同一份样品质粒转化农杆菌试验结果获得了一盆（三片叶子）经过含有GFP片段的根癌农杆菌侵染的本氏烟草，菌液基本充满了目标叶子。

3 总结与展望

本研究通过构建一种农杆菌介导的在烟草叶片中实现外源基因瞬时表达的体系，成功地实现了外源基因在本氏烟草上的快速而有效的表达。该方法具有较高的操作效率，为研究者们提供了一种新的、迅速的基因外部表达方式。农杆菌介导的基因瞬时表达技术在植物基因工程领域展现出了巨大的潜力。然而，在充分利用这一技术的同时，我们也要正视其存在的一些局限性。首先，农杆菌介导并非百分之百成功，其转化效率受到植物天然防御机制的制约，导致试验失败的风险存在[5]。解决这一问题需要深入研究植物与农杆菌互作的机制，寻找提高转化效率的途径。其次，瞬时表达的特性使得其在子代中无法稳定遗传。这对于作物改良和育种工作来说是一个挑战。未来的研究可以尝试通过进一步改良农杆菌介导技术，使得其表达能力更具持久性，能够稳定传递给后代。此外，农杆菌介导的基因瞬时表达在不同植物种类中可能存在差异。因此，未来的研究可以探索优化该技术以适应更广泛的植物类型，提高其通用性和适应性。通过克服其局限性，我们可以更好地利用这一技术，为未来植物科研和农业发展提供更多可能性。

参考文献

[1] 唐伶俐，徐龙兰，徐永阳，等.农杆菌介导的厚皮甜瓜遗传转化体系的建立[J].果树学报，2024（2）：1-14.

[2] 孙蔓莉，孟玉玲，张强，等.农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J].西北农业学报，2015，24（1）：161-165.

[3] 张悦婧，李颖，王娟娟，等.不同转化条件对3种农杆菌GFP基因在本氏烟草中瞬时表达的影响[J].植物研究，2022，42（1）：121-129.

[4] 蔡澜峰.根癌农杆菌介导甘蔗遗传转化技术研究[D].福州：福建农林大学，2010.

[5] 姚冉，石美丽，潘沈元，等.农杆菌介导的植物遗传转化研究进展[J].生物技术进展，2011，1（4）：6.